在植物体中基于同源重组提高基因编辑效率的方法技术

本发明专利技术涉及在植物体中基于同源重组提高基因编辑效率的方法，包括在植物细胞的组织培养过程中优化温度及光周期条件或者利用多复制子(multiple replicon)来表达同源介导的双链DNA修复(HDR，homology‑directed DNA repair)所需因子及效率增加因子或者调节非同源末端连接(NHEJ，non‑homologous end joining)途径的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在植物体中基于同源重组提高基因编辑效率的方法
本专利技术涉及在植物体中基于同源重组提高基因编辑效率的方法。
技术介绍
在植物系统中通过同源重组(HR，homologousrecombination)或同源介导的双链DNA修复(HDR，homology-directedDNArepair)的基因组校正技术在在植物基因工程研究中被认为是里程碑式的领域。虽然同源重组常发生在生成单倍体的生殖细胞的减数分裂中，但并未发生在体细胞的有丝分裂。据报告，同源介导的双链DNA修复为与非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)一同在DNA受损时发生的修复途径，同源介导的双链DNA修复的发生频率为非同源末端连接的1/1000。据1990年代初的报告，在烟草属植物(Nicotianaspecies)中双链断裂(DSB，doublestrandbreak)可增加同源介导的双链DNA修复，虽然早在20年前便已公开通过诱导双链断裂来使基因组变形的基因剪刀或基因组校正/编辑技术，但基因组校正/编辑技术的使用在植物系统中是非常受限的，而且，随着最近3代成簇的规律间隔的短回文重复序列/其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统的导入，提高同源介导的双链DNA修复效率的研究也逐渐活跃。若使用成簇的规律间隔的短回文重复序列/其相关蛋白9系统向基因组的特定位置基因造成双链断裂，则当通过作为在体细胞中优势的DNA修复途径的非同源末端连接途径发生DNA修复时，通常因不确定的修复可生成多种插入缺失(insertion-deletion，Indel)突变。虽然这种技术有利于获取随机化的插入缺失突变，但并不属于真正的基因组校正/编辑技术。基于同源介导的双链DNA修复的基因组校正/编辑技术是一种可以随意更改DNA碱基序列的技术，例如，外来基因的靶特异性插入、切割特定DNA片段或代替相似的DNA等，通过双链断裂的诱导可大幅提高同源介导的双链DNA修复的效率的事实在同源介导的双链DNA修复研究中起到非常重要的作用。然而，尽管双链断裂诱导大幅提高了同源介导的双链DNA修复的效率，但同源介导的双链DNA修复效率仍然非常低，仅为非同源末端连接的约1/100，这与实际应用相差甚远。因此，为了通过双链断裂改善植物同源介导的双链DNA修复技术，已经付出了许多努力，其中，通过使用病毒复制子(viralreplicon)取得了备受瞩目的进步。Baltes等(2014，PlantCell26(1)：151-163)通过使用诱导现有双链断裂的锌指核酸酶(ZFN，ZincFingerNuclease)和基于双生病毒(geminivirus)的病毒复制子来扩增同源介导的双链DNA修复模板，从而显著提高在烟草属植物中同源介导的双链DNA修复效率。将含有锌指核酸酶和同源介导的双链DNA修复模板的双生病毒复制子加载到三螺旋DNA并通过农杆菌注入到烟草后，若通过滚环式复制生成原型的复制子并通过表达锌指核酸酶来向有缺陷的GUS靶基因诱导双链断裂，则通过加载到复制子的同源介导的双链DNA修复模板产生同源介导的双链DNA修复。据报告，在番茄中同时使用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs，Transcriptionactivator-likeeffectornucleases)和CRISPR相关蛋白9(Cas9，CRISPRassociatedprotein9)的情况下，这种技术具有非常好的效果(Cermaketal.，2015，GenomeBiology16(1)：232)。作者们通过该论文作出了如下报告，即，以花色素通过同源介导的双链DNA修复过度积累的愈伤组织数量为基准所使用的每个子叶的同源介导的双链DNA修复效率约为10～13％，在这种条件下，若以三螺旋DNA插入在基因组的事件数量为基准进行换算，则可以为1～1.5％，而且，若以暂时表达转录激活因子样效应物核酸酶及Cas9的细胞为基准进行换算，则可以为0.1～0.15％，水平依然较低。相比仅使用现有双链断裂的三螺旋DNA系统，最少可提高5～10倍。但以具有同源介导的双链DNA修复事件的愈伤组织为基准，在获取产生同源介导的双链DNA修复的植物时会发生其他损失，因此，可从每1000个中期待1个左右，但由于这也需要利用通过花色素苷的积累报道分子使用及除草剂抗性或抗生素抗性上的特性，与基于同源介导的双链DNA修复的基因组编辑技术的普及相距甚远。根据最近发表的结果，虽然通过在水稻中使用稻矮缩病毒(WDV，Wheatdwarfvirus)复制子来将以T0转化体基准的的同源介导的双链DNA修复基因敲入(knock-in)效率提高至19.4％，在这种情况下，Cas9不仅使用预表达的愈伤组织，而且还可将作为抗生素抗性基因的NPTII结构体插入同源介导的双链DNA修复模板来作为通过抗生素进行筛选的结果，也距离在不插入外部基因且仅编辑靶基因的碱基序列的新育种基因技术相距甚远(Wangetal.2017，MolPlant.10(7)：1007-1010)。因此，进一步提高获得同源介导的双链DNA修复愈伤组织的效率以及优化从这种愈伤组织获得同源介导的双链DNA修复植物的过程为非常重要的步骤。基因组校正技术在动物系统中的进步要快于植物，在如老鼠或人的哺乳类情况下，同源介导的双链DNA修复的发生效率高于植物，这可能是部分性地由以寡核苷酸形式将多个分子传递至细胞的动物系统上的性质引起的。至今为止，在用于提高植物体细胞中同源介导的双链DNA修复效率的系统中最有效的系统为通过病毒复制子提供同源介导的双链DNA修复或同时表达和调节各种因子，以便提高额外同源介导的双链DNA修复的效率。但具有如下缺点，即，若将这种多个因子放入复制子，则随着复制子的大小增加，复制数量会减少并变得不稳定，因此，需要努力克服这一问题。此外，据报告，通过额外处理多种小的化学物质可提高同源介导的双链DNA修复效率。据报告，其中，抑制与同源介导的双链DNA修复具有竞争关系的非同源末端连接途径的多个化学物质抑制剂中用于抑制连接酶(ligase)IV的SCR7吡嗪(pyrazine)(2，3-二氢-6，7-二苯基-2-硫代-4-(1H)-蝶啶酮(2，3-Dihydro-6，7-diphenyl-2-thioxo-4(1H)-pteridinone))处理可提高同源介导的双链DNA修复约2～19倍。此外，据报告，虽然报告中能够提高重组酶(recombinase)RAD51的活性的RAD51蛋白激活剂-1(RS-1，RAD51-stimulatorycompound1)处理也能够在老鼠中提高同源介导的双链DNA修复效率，但尚未报告对植物系统起到作用。大部分的植物组织培养在22～25℃的条件下进行，相反，成簇的规律间隔的短回文重复序列/其相关蛋白9是否也能够在这种温度下进行还尚未可知。据最近的报告，在37℃的条件下，通过激活拟南芥系统中的Cas9功能可提高插入缺失突变的频率(LeBlancetal.，2018，PlantJ.93(2)：377-386)。但对于Cpf1(CRISPRfromPrev本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在植物体中基于同源重组提高基因编辑效率的方法，其作为利用基因剪刀系统的植物体的基因编辑方法，其特征在于，包括在植物细胞的组织培养过程中优化温度及光周期条件或者利用多复制子或者调节同源介导的双链DNA修复途径或非同源末端连接途径的步骤。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180122 KR 10-2018-00075791.一种在植物体中基于同源重组提高基因编辑效率的方法，其作为利用基因剪刀系统的植物体的基因编辑方法，其特征在于，包括在植物细胞的组织培养过程中优化温度及光周期条件或者利用多复制子或者调节同源介导的双链DNA修复途径或非同源末端连接途径的步骤。


2.根据权利要求1所述的在植物体中基于同源重组提高基因编辑效率的方法，其特征在于，包括在植物细胞的组织培养过程中优化温度及光周期条件、利用多复制子、调节同源介导的双链DNA修复途径或非同源末端连接途径的步骤。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的在植物体中基于同源重组提高基因编辑效率的方法，其特征在于，上述组织培养的温度条件为在共培养植物组织后，在29～33℃的条件下培养4～6天后，在26～30℃的条件下培养4～6天。


4.根据权利要求1或权利要求2所述的在植物体中基于同源重组提高基因编辑效率的方法，其特征在于，上述组织培养的光周期条件为由6～10小时的明期及14～18小时的暗期组成的短日照条件。


5.根据权利要求1或权利要求2所述的在植物体中基于同源重组提高基因编辑效率的方法，其特征在于，上述复制子为基于双生病毒的复制子。


6.根据权利要求1或权利要求2所述的在植物体中基于同源重组提高基因编辑效率的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：金在演，吴天万，韦鲁·斯万卡雅尼，米尔蒂·川，金知谐，成演瑀，郑世正，金贤晶，
申请(专利权)人：庆尚大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国;KR