阿洛酮糖的制备方法技术

本发明专利技术涉及阿洛酮糖的制备方法，更详细地，涉及如下的阿洛酮糖的制备方法，其包括：在果糖及阿洛酮糖的混合物中添加甘露醇脱氢酶来使上述果糖转换为甘露醇的步骤；以及从上述混合物中分离上述甘露醇的步骤。由此，可提高阿洛酮糖生产能力，并以高纯度分离阿洛酮糖。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】阿洛酮糖的制备方法
本专利技术涉及能够以高纯度分离阿洛酮糖的阿洛酮糖的制备方法。
技术介绍
阿洛酮糖(D-psicose)为果糖(D-fructose)的3号碳的差向异构体(epimer)，虽然像普通糖类一样具有甜味，但由于无法在人体内代谢，因而属于因卡路里几乎为零而对糖尿病及肥胖患者而言可作为代替白糖的功能性甜味剂来使用的功能性糖。并且，具有通过抑制在肝脏参与脂质合成的酶的活性来减少腹部肥胖的功能，是当前作为糖尿病和动脉硬化治疗剂来进行研究的糖。像这样，随着阿洛酮糖作为甜味剂备受瞩目，在食品产业领域，开发可有效生产阿洛酮糖的方法的必要性逐渐增加。由于在天然物质内的糖蜜处理过程或葡萄糖异构化反应过程中存在非常少量的阿洛酮糖，因而现有的阿洛酮糖生产主要通过化学过程来实现。比利克(Bilik)等人曾开发利用钼酸(molybdicacid)离子的催化作用来从果糖生产阿洛酮糖的技术。麦克唐纳(McDonald)通过对1,2:4,5-二-o-丙酮缩甘油-β-D-果糖(1,2:4,5-di-o-ispropylidene-bata-D-fructopyranose)进行三步骤化学处理过程来生产了阿洛酮糖。并且，多纳(Doner)通过对乙醇、三乙胺及果糖一同进行加热的方法生产了阿洛酮糖。但是，这些通过化学方法生产阿洛酮糖的方法花费很多费用，相反，存在生产效率低、产生大量副产物的问题。作为基于生物学方法实现的阿洛酮糖生产方法，肯·伊兹莫里(KenIzumori)等人证实了可利用微生物细胞反应来从半乳糖醇(galacitol)、d-塔格糖(D-tagatose)或D-塔罗糖醇(D-talitol)等生产阿洛酮糖。但是，这些底物属于自然界中非常稀缺的糖或糖醇，具有成本高的缺点。酶转换方法有在重组大肠杆菌中生产并纯化分离微生物菊苣假单胞菌ST-24(PseudomonascichoriiST-24)的D-塔格糖-3-差向异构酶(D-tagatose-3-epimerase)来使果糖酶转换为阿洛酮糖的方法，肯·伊兹莫里等人曾利用固定D-塔格糖-3-差向异构酶的反应系统来以25％的转换率生产了阿洛酮糖。根据这种现有技术，为了从果糖生产阿洛酮糖，以往以通过纯化酶，固定所纯化的酶来提高阿洛酮糖生产率的方向进行了研究。但这种酶纯化过程实际需要很多时间和费用。另一方面，果糖具有与阿洛酮糖类似的物性，从而即使生产阿洛酮糖，也存在难以从果糖中分离其的问题。因此，需要能够以高效率生产阿洛酮糖且容易分离其的阿洛酮糖的生产方法。现有技术文献专利文献韩国公开专利第2013-0029754号
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的在于，提供能够以高纯度分离阿洛酮糖的阿洛酮糖的制备方法。本专利技术的目的在于，提供阿洛酮糖的生产能力得到改善的阿洛酮糖的制备方法。解决问题的方案本专利技术的一实施方式提供阿洛酮糖的制备方法，其包括：在果糖及阿洛酮糖的混合物中添加甘露醇脱氢酶来使上述果糖转换为甘露醇的步骤；以及从上述混合物中分离上述甘露醇的步骤。作为阿洛酮糖的代表性的制备方法，可例举利用催化剂来将果糖转换为阿洛酮糖的化学方法、将对催化从果糖到阿洛酮糖的转换的酶进行编码的基因导入于微生物，来从中将果糖转换为阿洛酮糖的生物学方法等。这些方法具有均将果糖用作底物的共同点，果糖和阿洛酮糖的物性类似，从而存在难以从反应混合物中分离阿洛酮糖的问题。但是，本专利技术人着眼于可使果糖和阿洛酮糖的混合物与甘露醇脱氢酶发生反应来将果糖转换为甘露醇，并从甘露醇中分离阿洛酮糖，来更容易且高效率地分离阿洛酮糖的情况，从而完成了本专利技术。以下，详细说明本专利技术。根据本专利技术的一实例，首先，在果糖及阿洛酮糖的混合物中添加甘露醇脱氢酶来使上述果糖转换为甘露醇。上述果糖及阿洛酮糖的混合物是通过化学或生物学方法来将果糖转换为阿洛酮糖之后的经转换的阿洛酮糖和未转换的果糖的混合物。对此，本专利技术还可包括如下步骤：使作为底物的果糖与其差向异构酶发生反应，来制备上述果糖及阿洛酮糖的混合物。上述差向异构酶可以为阿洛酮糖-3-差向异构酶，具体地，可以为来源于根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的阿洛酮糖-3-差向异构酶或来源于粪厌氧棒状菌(Anaerostipescaccae)的阿洛酮糖-3-差向异构酶。对上述差向异构酶进行编码的基因可以为对来源于序列1的根癌土壤杆菌的阿洛酮糖-3-差向异构酶进行编码的基因或对来源于序列2的粪厌氧棒状菌的阿洛酮糖-3-差向异构酶进行编码的基因。来源于根癌土壤杆菌的阿洛酮糖-3-差向异构酶可具有序列3的氨基酸序列，来源于粪厌氧棒状菌的阿洛酮糖-3-差向异构酶可具有序列4的氨基酸序列。差向异构酶具有更优秀的高温稳定性，从这个方面来看，优选地，对差向异构酶进行编码的基因可以为对序列5的阿洛酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序列进行编码的基因。上述序列5的氨基酸序列为来源于根癌土壤杆菌的阿洛酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序列中的第33个氨基酸被亮氨酸取代且第213个氨基酸被半胱氨酸取代的序列，其热稳定性优秀。本专利技术的专利技术人确认了来源于梭菌属的阿洛酮糖-3-差向异构酶具有优秀的热稳定性，参照图7，在热稳定性高的来源于梭菌属的阿洛酮糖-3-差向异构酶的情况下，一个氨基酸具有与其相对应的序列，或具有如上所述的两个序列。对此，不仅是来源于根癌土壤杆菌的阿洛酮糖-3-差向异构酶，来源于其他菌株的阿洛酮糖-3-差向异构酶也被确认到与来源于上述根癌土壤杆菌的阿洛酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序列的第33个氨基酸、第213个氨基酸相对应的氨基酸序列为对提高热稳定性重要的序列。这种氨基酸序列的具体的例可例举在序列6的氨基酸序列中第32个氨基酸被亮氨酸取代或第196个氨基酸被半胱氨酸取代的序列。序列6为对图7中的用方框所标注的序列进行排列的序列，是在本专利技术中所使用的根癌土壤杆菌、粪厌氧棒状菌、鲍氏梭菌(Clostridiumbolteae)、来源于门冬虫梭菌(Clostridiumhylemonae)的阿洛酮糖-3-差向异构酶氨基酸序列(序列3、序列4、序列9、序列10)的共同碱基序列。因此，上述微生物可以为被对上述氨基酸序列进行编码的基因取代的，但并不限定于此。并且，同样，从优秀的高温稳定性、阿洛酮糖的生产能力方面来看，差向异构酶可以为来源于梭菌属的阿洛酮糖-3-差向异构酶，对其进行编码的基因可以为对来源于序列7的鲍氏梭菌的阿洛酮糖-3-差向异构酶进行编码的基因或对来源于序列8的门冬虫梭菌的阿洛酮糖-3-差向异构酶进行编码的基因。从将高温稳定性极大化的方面来看，优选地，可以为对来源于序列8的门冬虫梭菌的阿洛酮糖-3-差向异构酶进行编码的基因。来源于鲍氏梭菌的阿洛酮糖-3-差向异构酶可具有序列9的氨基酸序列，来源于门冬虫梭菌的阿洛酮糖-3-差向异构酶可具有序列10的氨基酸序列。在所例示的上述阿洛酮糖-3-差向异构酶中，来源于粪厌氧棒状菌的阿洛酮糖-3-差向异构酶、具有在序列6的氨基酸序列中的第32个氨基酸被亮氨酸取代或第196个氨基酸被半胱氨酸取代的序列的阿洛酮糖-3-差向异构酶、来源于鲍氏梭菌的阿洛酮糖-3-差向异构酶及来源于门冬虫梭菌的阿洛酮糖-3-差向异构酶的表示最佳活性的pH为7以下。果糖和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种阿洛酮糖的制备方法，其特征在于，包括：在果糖及阿洛酮糖的混合物中添加甘露醇脱氢酶来使上述果糖转换为甘露醇的步骤；以及从上述混合物中分离上述甘露醇的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.06 KR 10-2014-01539491.一种阿洛酮糖的制备方法，其特征在于，包括：在果糖及阿洛酮糖的混合物中添加甘露醇脱氢酶来使上述果糖转换为甘露醇的步骤；以及从上述混合物中分离上述甘露醇的步骤。2.根据权利要求1所述的阿洛酮糖的制备方法，其特征在于，上述甘露醇脱氢酶为来源于具有序列43的氨基酸序列的假肠膜明串珠菌ATCC12291的甘露醇-2-脱氢酶、来源于具有序列44的氨基酸序列的肠膜明串珠菌的甘露醇-2-脱氢酶或来源于具有序列45的氨基酸序列的类球红细菌的甘露醇-2-脱氢酶或来源于具有序列46的氨基酸序列的荧光假单胞菌DSM50106的甘露醇-2-脱氢酶。3.根据权利要求1所述的阿洛酮糖的制备方法，其特征在于，使上述果糖转换为甘露醇的步骤在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸供给源的存在下执行。4.根据权利要求3所述的阿洛酮糖的制备方法，其特征在于，上述还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸供给源为甲酸及甲酸脱氢酶。5.根据权利要求1所述的阿洛酮糖的制备方法，其特征在于，使上述果糖转换为甘露醇的步骤利用包含对甘露醇脱氢酶进行编码的基因的微生物来执行。6.根据权利要求5所述的阿洛酮糖的制备方法，其特征在于，上述微生物为棒状杆菌属微生物。7.根据权利要求5所述的阿洛酮糖的制备方法，其特征在于，使上述果糖转换为甘露醇的步骤在包含甲酸的培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：金善元，崔珉搢，郑圣憙，李大尹，
申请(专利权)人：庆尚大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国,KR