一种利用水稻内源序列的RNAi植物表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种利用水稻内源序列的RNAi植物表达载体及其应用，以及一种干扰植物细胞色素P450基因CYP81A6表达的方法和获得除草剂显性敏感植物的方法。将本发明专利技术的RNAi植物表达载体转化水稻，能够成功抑制基因CYP81A6的表达，并将水稻从对除草剂具有抗性转变为敏感，使得敏感植株可以通过施用除草剂的方式被清除，从而培育了一种对除草剂显性敏感的水稻。该水稻在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种利用水稻内源序列的RNAi植物表达载体及其应用
本专利技术属于农业生物
，具体涉及一种利用水稻内源序列的RNAi植物表达载体和其构建方法和应用。
技术介绍
农作物杂种优势利用是农业增产重要手段之一。水稻是全世界最重要的粮食作物之一，具有明显的杂种优势。中国是世界上首个成功实现杂交水稻商品化生产的国家，杂交水稻使我国水稻产量提高了20％，全国杂交水稻常年种植面积已超过水稻年播种面积的50％。“三系法”和“两系法”是目前杂交水稻制种的主要方法，但由于三系核质互作的基因型限制及两系的光温敏在特殊条件下的不稳定，杂交水稻产业的发展已受到制约。美国先锋公司的SPT技术利用转基因技术成功解决了杂交制种中的一系列问题，并于2012年在玉米中实现商业化应用，水稻杂交制种也极有可能利用类似SPT技术实现更新换代。同时，转基因技术在各种农作物领域的应用越来越广泛。然而转基因产品自诞生之日起产生的争议，至今仍甚嚣尘上。因此，转基因产品需要加以严格的控制和监管，防止转基因漂移污染其他品种甚至其他物种就显得尤为重要。因此，需要建立一种能够定向清除杂交种子或转基因植株的机制。培育获得除草剂敏感的不育系是解决问题的有效手段之一。苯达松(bentazon)是一种苯并噻二唑类除草剂，属杂环类选择性化学除草剂，多数阔叶类杂草和莎草科杂草对苯达松敏感，而包括水稻在内的禾本科和豆科植物则对其有较强的耐药性，苯达松具有广谱，高效，低毒的特性。因此，苯达松用于清除稻田的阔叶类杂草和莎草科杂草十分有效，而对水稻又十分安全(张集文(2010)水稻苯达松敏感突变研究进展.中国水稻科学24:551-558)。水稻对苯达松抗性由一个单隐性基因细胞色素P450(CYP81A6)控制，该基因位于水稻第3号染色体上，参与苯达松在植物体内的羟基化脱毒过程。苯达松敏感型突变体“Norin8m”、“M8077S”、“嘉浙mB”、“GZmlS”和“GZm2S”等都是由于CYP81A6基因突变造成的。CYP81A6基因的突变，导致上述突变体无法在体内降解苯达松，从而导致喷施苯达松除草剂时，植物死亡。同时，该细胞色素P450也是磺酰脲类除草剂的作用靶标，包含CYP81A6突变基因或苯达松敏感的植物，在喷施磺酰脲类除草剂时，也会导致死亡。因此，开发出一种能够有效显性影响水稻细胞色素P450(CYP81A6)表达的技术手段，可为杂交水稻制种、培育转基因新品种、防止转基因逃逸等方面提供有效管控方案。RNA干扰技术(RNAi技术)可达到显性抑制基因表达的目的。RNAi典型结构由茎和环组成，具体为两段反向互补的序列形成茎及两段反向互补序列之间的一段间隔序列形成环，其互补的茎结构为靶基因位点序列，其环序列理论上可以为任何与茎序列不相关的序列，但实际应用中发现不同茎、不同环其干扰效率差异非常大。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够有效的影响水稻细胞色素P450(CYP81A6)表达的植物表达载体及其构建方法：为达到以上目的，本专利技术提供了一种抑制细胞色素P450基因表达的RNAi植物表达载体，含有发卡结构表达盒，其中所述发卡结构表达盒含有由SEQIDNo.1-3所示的DNA片段所形成的发卡结构。其中，SEQIDNo.1所示的DNA片段为基于CYP81A6编码框的长度为258bp的正向DNA片段，SEQIDNo.3所示的DNA片段为基于CYP81A6编码框的长度为258bp的与SEQIDNo.1所示的DNA片段反向互补的DNA片段。SEQIDNo.2为来自水稻CYP81A6基因的内含子。SEQIDNo.1至3所示的DNA片段按照从上游到下游的方向依次排列。该发夹表达盒可在转化的植物细胞中转录形成发卡式的二级结构，SEQIDNo.2所示的DNA片段形成发卡的“环”，SEQIDNo.1和3所示的DNA片段互补形成发卡的“茎”。其中，所述发卡结构表达盒还包括位于发卡结构上游的植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，以及，位于发卡结构下游的终止子。其中所述植物组成型启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、CAMV35S启动子或Actin启动子；所述植物组织特异性启动子为Rubisco小亚基启动子或Cab启动子。优选的，当启动子为水稻或玉米的Ubi启动子时，能够取得非常强的干扰CYP81A6基因表达的效果。所述终止子包括：NOS终止子，Ubi终止子等在植物中可以终止基因转录的DNA序列。优选的，所述终止子为NOS终止子。所述RNAi植物表达载体还包括选择标记表达盒，所述选择标记表达盒含有启动子、标记基因和终止子，其中所述启动子为水稻或玉米的Ubi启动子，CAMV35S启动子或Actin启动子，优选的，当启动子为CAMV35S启动子时，能够取得良好的驱动选择标记基因在植物中超量表达的效果。所述终止子为NOS终止子或Ubi终止子，优选为NOS终止子。所述标记基因为可产生颜色变化的酶的基因(如GUS基因、荧光素酶基因等)、荧光标记基因(如荧光蛋白基因)、抗生素标记基因(可供筛选的抗生素标记如潮霉素、庆大霉素、卡那霉素基因)、除草剂筛选标记基因(如抗草甘膦基因、抗双草醚基因等)或抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因等)。特别优选的，所述标记基因为潮霉素基因。在本专利技术的一种优选的实施方式中，所述的RNAi植物表达载体是将SEQIDNo.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pCAMBIA1300-Ubi-Nos的AscⅠ和BamHⅠ位点间，得到RNAi植物表达载体pC1300-UN-P450i-10。特别优选的，所述的RNAi植物表达载体，具有SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。其中，所述植物为水稻，优选的，所述植物为转基因水稻株系。值得注意的是，用于RNAi植物表达载体构建的中间载体和具有选择标记基因的RNAi表达载体，工程菌及包含P450i-10茎环结构的细胞、愈伤组织、转基因苗、种子等均属于本专利技术的保护范围。本专利技术的另一个方面还提供了一种RNAi植物表达载体的构建方法，所述方法包括：SEQIDNo.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pCAMBIA1300-Ubi-Nos的AscⅠ和BamHⅠ位点间，得到RNAi植物表达载体pC1300-UN-P450i-10。具体的，所述方法可以按照以下步骤进行：(1)由于SEQIDNo.1和2在水稻基因组上为顺序排列，故可通过一对引物(P450i-10-1F/R)一次性扩增获得SEQIDNo.1和2顺序连接的片段，故设计2对引物，分别扩增SEQIDNo.1-3所示的DNA片段其中相邻的两个片段上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与片段或载体相应连接位置重复，以便利用GibsonAssembly重组连接。具体引物信息如下：P450i-10-1FgttacttggcgcgccATCCCGCACATCGGCGCGGCCAAP450i-10-1Racagctctaacggcg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制细胞色素P450基因表达的RNAi植物表达载体，其特征在于，含有发卡结构表达盒，其中所述发卡结构表达盒含有由SEQ ID No.1-3所示的DNA片段所形成的发卡结构。/n

【技术特征摘要】
1.一种抑制细胞色素P450基因表达的RNAi植物表达载体，其特征在于，含有发卡结构表达盒，其中所述发卡结构表达盒含有由SEQIDNo.1-3所示的DNA片段所形成的发卡结构。


2.根据权利要求1所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，所述发卡结构表达盒还包括位于发卡结构上游的植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，以及，位于发卡结构下游的终止子，
其中所述植物组成型启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、CAMV35S启动子或Actin启动子；所述植物组织特异性启动子为Rubisco小亚基启动子或Cab启动子。


3.根据权利要求1所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，还包括选择标记表达盒，所述选择标记表达盒含有启动子、标记基因和终止子，其中所述启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、CAMV35S启动子，或Actin启动子；所述标记基因为可产生颜色变化的酶的基因、荧光标记基因、抗生素标记基因、除草剂筛选标记基因或抗化学试剂标记基因，所述终止子为NOS终止子或Ubi终止子。


4.根据权利要求1-3中任意一项所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，具有SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。


5.含有权利要求1-4任一所述的RNAi植物表达载体的生物材料，所述生物材料为工程菌、包含P450i-10茎环结构的细胞或愈伤组织。


6.一种RNAi植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括：将S...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳超，安保光，陈思兰，曾翔，吴永忠，黄培劲，
申请(专利权)人：海南波莲水稻基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：海南;46