一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法技术

本发明专利技术涉及一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，根据NCBI数据库中序列信息，同源克隆获得目的基因，通过酶切‑连接将目的基因整合到植物过表达质粒载体中，再将重组植物载体转入农杆菌GV3101中。在LB培养基中28℃震荡培养农杆菌至OD600达1.0~1.2，离心集菌，倒去LB培养基，使用含有MgCl

【技术实现步骤摘要】
一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法
本专利技术属于生物技术工程领域，尤其涉及一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法。
技术介绍
枣树（ZiziphusjujubaMill.）为鼠李科（Rhamnaceae）枣属（ZiziphusMill.）植物，原产于我国黄河中下游地区，已有3000多年栽培历史。改革开放以来，枣产业发展迅速，已成为我国第一大干果树种，产量占到世界99%。枣果实营养极为丰富，据测定，枣果的环磷酸腺苷（cAMP）、维生素C、碳水化合物等重要食疗成分的含量居百果前茅。我国在枣树研究上处于国际领先地位。2014年，本课题组在世界上率先完成了枣全基因组测序，组装基因组437.65Mb，注释基因32808个。基于此，大量调控重要性状形成的候选关键基因被相继报道。但是，枣树转基因技术不成熟，枣树的基因稳定遗传转化体系鲜有报道，且转化效率低、可重复性差、耗时长；另一方面，枣树的基因瞬时表达技术体系目前尚无报道，导致枣树基因功能验证研究受到很大限制。基因瞬时表达技术虽无法获得可遗传的转化植株（目的基因被导入寄主细胞，但未整合到寄主基因组中），但目的基因进入植物细胞后12h就可以表达，并持续80h以上。瞬时表达技术简单、快速的优势是稳定遗传转化所不能比拟的。果实性状对果树而言是最重要的性状。就果实品质性状而言，在果实发育的关键时期，进行基因瞬时表达调控研究是验证品质形成基因功能的一种行之有效的方法。因此，以在体枣果实为材料，建立调控果实品质性状形成相关基因的瞬时表达体系意义重大。本专利技术首次实现了以在体枣果实为材料的基因瞬时表达。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，利用这种方法可直接在枣树上对众多果实发育相关基因进行功能验证，规避了枣树稳定遗传转化方法存在的重复性差、转化率低、耗时长等诸多问题。为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下。一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，包括以下步骤：步骤1，克隆待验证的目的基因：提取枣组织器官的RNA，经反转录得到cDNA作为PCR扩增的模版，以待验证目的基因的序列信息设计引物A，进行PCR扩增，获得目的基因的DNA。步骤2，重组过表达载体的构建：将步骤1克隆的目的基因整合至植物过表达载体，构建植物重组过表达载体，并将所述植物重组过表达载体转入农杆菌GV3101中，获得携带重组质粒的农杆菌。步骤3，注射侵染在体枣果实：以在体枣果实作为侵染靶目标，用步骤2获得的携带重组质粒的农杆菌进行注射侵染，并避光24h。步骤4，目的基因的功能验证：进行注射果实的基因表达量分析及功能验证，即可。进一步的，所述待验证目的基因为腺苷酸环化酶基因。进一步的，步骤2中所述植物过表达载体采用pCG3301质粒。进一步的，步骤3中所述枣果实处于半红期。进一步的，步骤3中，注射侵染时，采用注射器，将携带重组质粒的农杆菌的渗透液从半红期枣果实的果柄处缓慢注满果实，保证含有农杆菌的渗透液注射完全，然后用锡箔纸包裹注射果实所在的结果枝进行避光，24h后取下锡箔纸，即可。进一步的，当步骤1中的待验证的目的基因的序列信息为未知序列，来源于枣全基因组数据库时，采用同源克隆的方法进行待验证的目的基因的克隆。更进一步的，当步骤1中的待验证的目的基因的序列信息为未知序列，来源于枣全基因组数据库时，所述克隆待验证的目的基因的具体操作步骤如下。步骤1-A：取冬枣半红时期果实，加入液氮研磨成粉后，提取枣果实RNA，并将得到的RNA反转录成cDNA，备用。步骤1-B：目的基因的获得：根据NCBI中注释的若干植物的候选目的基因的共同保守序列设计同源克隆引物，经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，获得特异条带，切胶回收后进行一代测序获得所述特异条带中候选基因的DNA序列；利用获得的所述候选基因的DNA序列的表达标签，搜索枣全基因组数据库，找到与所述候选基因的DNA序列一致的基因序列，即为目的基因。步骤1-C：以所述枣全基因组数据库中记载的目的基因的序列信息设计引物A。步骤1-D：PCR扩增：以步骤1-A获得的cDNA为模版，基于步骤1-C设计的引物A，进行PCR扩增。步骤1-E：将步骤1-D进行PCR扩增后的体系溶液通过琼脂糖凝胶电泳，获得阳性条带，回收阳性条带的DNA，对回收的DNA进行测序验证，获得目的基因的DNA，并对目的基因的序列信息进行更正。进一步的，当步骤1中的待验证的目的基因的序列信息为已知序列时，所述克隆待验证的目的基因的具体操作步骤如下。步骤1-a：取冬枣半红时期果实，加入液氮研磨成粉后，提取枣果实RNA，并将得到的RNA反转录成cDNA，备用。步骤1-b：以所述目的基因的序列信息设计引物A。步骤1-c：PCR扩增：以步骤1-a获得的cDNA为模版，基于步骤1-b设计的引物A，进行PCR扩增。步骤1-e：将步骤1-c进行PCR扩增后的体系溶液通过琼脂糖凝胶电泳，获得阳性条带，回收阳性条带的DNA，对回收的DNA进行测序验证，获得目的基因的DNA。进一步的，步骤2中所述重组过表达载体的构建的具体的操作步骤如下：步骤2-1：酶切：植物过表达载体选择携带35S强启动子、GFP标签、卡那霉素抗性基因的质粒载体，使用限制性内切酶切断所述质粒载体，酶切位点位于GFP标签前，获得酶切后的质粒载体，备用。步骤2-2：以目的基因的序列信息设计引物B，并以步骤1中获得的目的基因的DNA为模版，进行PCR扩增后，获得两端加有15bp载体序列的目的基因。步骤2-3：采用连接酶将步骤2-2获得的加长目的基因连接至步骤2-1获得的酶切后的质粒载体上，获得重组质粒。步骤2-4：将步骤2-3获得的重组质粒转入DH5α感受态细胞后，富集培养，获得富集有重组质粒的菌液。步骤2-5：提取步骤2-4获得的富集有重组质粒的菌液中的重组质粒，并将提取的重组质粒采用冻融转化法转入农杆菌GV3101中，获得携带重组质粒的农杆菌。更进一步的，步骤2-1中所述限制性内切酶采用SmaI快切酶。进一步的，步骤3中注射侵染在体枣果实的具体的操作步骤如下：步骤3-1：将步骤2获得的携带重组质粒的农杆菌活化培养后，悬浮于渗透液中，并调整菌液浓度为OD600=0.6~0.8，即得含有农杆菌的渗透液。步骤3-2：将步骤3-1获得的含有农杆菌的渗透液从半红期枣果实的果柄处缓慢注满果实，保证含有农杆菌的渗透液注射完全，然后用锡箔纸包裹注射果实所在的结果枝进行避光，24h后取下锡箔纸，即可。更进一步的，步骤3-1中所述渗透液中包括10mMMES，10mMMgCl2和200mM乙酰丁香酮，且pH=6.0。进一步的，步骤4中所述目的基因的功能验证的具体方法为：分别于注射前、注射后24h和注射后72h观察枣果实表观变化，并采集枣果实样品进行RNA提取、荧光定量PCR检测和相本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1、克隆待验证的目的基因：提取枣组织器官的RNA，经反转录得到cDNA作为PCR扩增的模版，以待验证目的基因的序列信息设计引物A，进行PCR扩增，获得目的基因的DNA；/n步骤2、重组过表达载体的构建：将步骤1克隆的目的基因整合至植物过表达载体，构建植物重组过表达载体，并将所述植物重组过表达载体转入农杆菌GV3101中，获得携带重组质粒的农杆菌；/n步骤3、注射侵染在体枣果实：以在体枣果实作为侵染靶目标，用步骤2获得的携带重组质粒的农杆菌进行注射侵染，并避光24h；/n步骤4、目的基因的功能验证：进行注射果实的基因表达量分析及功能验证，即可。/n

【技术特征摘要】
1.一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、克隆待验证的目的基因：提取枣组织器官的RNA，经反转录得到cDNA作为PCR扩增的模版，以待验证目的基因的序列信息设计引物A，进行PCR扩增，获得目的基因的DNA；
步骤2、重组过表达载体的构建：将步骤1克隆的目的基因整合至植物过表达载体，构建植物重组过表达载体，并将所述植物重组过表达载体转入农杆菌GV3101中，获得携带重组质粒的农杆菌；
步骤3、注射侵染在体枣果实：以在体枣果实作为侵染靶目标，用步骤2获得的携带重组质粒的农杆菌进行注射侵染，并避光24h；
步骤4、目的基因的功能验证：进行注射果实的基因表达量分析及功能验证，即可。


2.根据权利要求1所述的一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，步骤2中所述植物过表达载体采用pCG3301质粒。


3.根据权利要求1所述的一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，步骤3中所述枣果实处于半红期。


4.根据权利要求1所述的一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，步骤3中，注射侵染时，采用注射器，将携带重组质粒的农杆菌的渗透液从半红期枣果实的果柄处缓慢注满果实，保证含有农杆菌的渗透液注射完全，然后用锡箔纸包裹注射果实所在的结果枝进行避光，24h后取下锡箔纸，即可。


5.根据权利要求1所述的一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，当步骤1中的待验证的目的基因的序列信息为未知序列，来源于枣全基因组数据库时，采用同源克隆的方法进行待验证的目的基因的克隆。


6.根据权利要求5所述的一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，当步骤1中的待验证的目的基因的序列信息为未知序列，来源于枣全基因组数据库时，所述克隆待验证的目的基因的具体操作步骤如下：
步骤1-A、取冬枣半红时期果实，加入液氮研磨成粉后，提取枣果实RNA，并将得到的RNA反转录成cDNA，备用；
步骤1-B：目的基因的获得：根据NCBI中注释的若干植物的候选目的基因的共同保守序列设计同源克隆引物，经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，获得特异条带，切胶回收后进行一代测序获得所述特异条带中候选基因的DNA序列；利用获得的所述候选基因的DNA序列的表达标签，搜索枣全基因组数据库，找到与所述候选基因的DNA序列高度同源的基因序列，即为目的基因；
步骤1-C、以所述枣全基因组数据库中记载的目的基因的序列信息设计引物A；
步骤1-D、PCR扩增：以步骤1-A获得的cDNA为模版，基于步骤1-C设计的引物A，进行PCR扩增；
步骤1-E、将步骤1-D进行PCR扩增后的体系溶液通过琼脂糖凝胶电泳，获得阳性条带，回...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘孟军，刘志国，袁野，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北;13