【技术实现步骤摘要】
一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法
本专利技术涉及植物基因工程领域，尤指一种用于水稻或单子叶植物的增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法。
技术介绍
基因的多样性是研究植物性状和遗传的重要资源。千百年来，植物的驯化依赖于自然变异的人工选择，但此过程中变异的方向是随机的，变异的频率也很低。为了创制新的品种，育种学家们利用了各种方法向植物基因组中引入突变，包括物理诱变、化学诱变和生物诱变等，但是这些突变的方向都不能控制。如果可以对目标序列进行定点编辑，将对作物遗传改良和植物基因功能研究起着重要作用。基因编辑技术是一种通过人工设计和改造核酸酶达到对基因进行定点修饰的技术。目前发展起来的基因编辑技术主要包括第一代的锌指核酸酶(ZFNs,zincfinernucleases)、第二代的转录激活子样效应子介导核酸酶(TALENs,transcriptionactivator-likeeffectornucleases)和近几年兴起的第三代CRISPR/Cas9系统。其中CRISPR/Cas9系统由于操...
【技术保护点】
1.一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于，该方法包括：/n利用U
【技术特征摘要】
1.一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于，该方法包括：
利用U3表达盒与U6a表达盒连接的构造工序、基于U3表达盒和U6a连接生成的产物与MH质粒连接的重组工序以及重组后的产物导入到大肠杆菌中的工序，其中，利用U3表达盒与U6a表达盒连接的构造工序的具体步骤为：
采用OverlappingPCR法分别得到U3表达盒SEQIDNO：2片段和U6a表达盒SEQIDNO：3片段,并将U3表达盒和U6a表达盒连接起来。包括OverlappingPCR法的三个反应体系：PCR1、PCR2、PCR3，PCR1的上下游引物分别为：U-F、gRNA-R；PCR2的上游引物为B1’-M、B2’-M，下游引物为B2-M、BL-M；PCR3的引物为U3’、U6a’，所述引物序列为：
B1’-M：5’-caacgcttctgtttcgcaagGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’，
B2-M：5’-cgagcccaagacactcctctGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’，
B2’-M：5’-agaggagtgtcttgggctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’，
BL-M：5’-TCGATGTTGACGAAGCGAGTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3’，
U3’：5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAcaacgcttctgtttcgcaag-3’，
U6a’：5’-AGCGTGggtctcGaccgACGCGTTCGATGTTGACGAAGCGAGT-3’；
PCR1:将靶点序列引入到启动子的下游和gRNA序列的上游，此轮PCR包括四个PCR反应；
PCR2:将启动子片段和gRNA片段连接在一起，得到U3表达盒和U6a表达盒，此轮PCR包括两个PCR反应；
PCR3:将U3和U6a表达盒产物连接起来，同时使U3片段的5’端和U6a片段的3’端带上...
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