一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法技术方案

本发明专利技术涉及植物基因工程领域，尤指一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，本发明专利技术在PCR2后添加了一轮将U

【技术实现步骤摘要】
一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法
本专利技术涉及植物基因工程领域，尤指一种用于水稻或单子叶植物的增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法。
技术介绍
基因的多样性是研究植物性状和遗传的重要资源。千百年来，植物的驯化依赖于自然变异的人工选择，但此过程中变异的方向是随机的，变异的频率也很低。为了创制新的品种，育种学家们利用了各种方法向植物基因组中引入突变，包括物理诱变、化学诱变和生物诱变等，但是这些突变的方向都不能控制。如果可以对目标序列进行定点编辑，将对作物遗传改良和植物基因功能研究起着重要作用。基因编辑技术是一种通过人工设计和改造核酸酶达到对基因进行定点修饰的技术。目前发展起来的基因编辑技术主要包括第一代的锌指核酸酶(ZFNs,zincfinernucleases)、第二代的转录激活子样效应子介导核酸酶(TALENs,transcriptionactivator-likeeffectornucleases)和近几年兴起的第三代CRISPR/Cas9系统。其中CRISPR/Cas9系统由于操作简单、设计灵活、价格低廉、能实现多点编辑、可扩展性强，成为应用最广、研究最透彻的系统。该系统有gRNA和Cas9蛋白两部分组成。gRNA首先通过自身的Cas9把手与Cas9蛋白形成复合体，然后复合体搜寻并匹配PAM序列，随后gRNA识别靶序列，最后Cas9蛋白对靶序列进行切割，形成DNA双链断裂(Double-strandbreak，DSB)(JinekM,ChylinskiK,FonfaraI,etal.Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science,2012,337:816–821)。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，由于其基因组小、易于操作、遗传转化体系高效，适合用于基因编辑技术的研究。华南农业大学刘耀光院士团队开发了一套适合于植物的多靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体系统(MaX,ZhangQ,ZhuQ,etal.ArobustCRISPR/Cas9systemforconvenient,high-efficiencymultiplexgenomeeditinginmonocotanddicotplants.Molecularplant,2015,8(8):1274-1284)，该方法可以同时编辑植物基因组的多个靶位点。当有两个靶点时，该方法通过一次OverlappingPCR分别得到U3和U6a表达盒，然后通过一次边切边连将U3表达盒、U6a表达盒和MH质粒三个片段连接在一起，由于T4连接酶连接效率有限，经常出现只连接上了U3、只连接上了U6a或者空载的情况，导致阳性克隆的比例非常低，基因编辑效率较低。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其目的在于，解决现有技术中水稻等植物基因编辑效率慢的问题。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于，该方法包括：利用U3表达盒与U6a表达盒连接的构造工序、基于U3表达盒和U6a连接生成的产物与MH质粒连接的重组工序以及重组后的产物导入到大肠杆菌中的工序，其中，利用U3表达盒与U6a表达盒连接的构造工序的具体步骤为：采用OverlappingPCR法分别得到U3表达盒SEQIDNO：2片段和U6a表达盒SEQIDNO：3片段，并将U3表达盒和U6a表达盒连接起来。包括OverlappingPCR法的三个反应体系：PCR1、PCR2、PCR3，PCR1的上下游引物分别为：U-F、gRNA-R；PCR2的上游引物为B1’-M、B2’-M，下游引物为B2-M、BL-M；PCR3的引物为U3’、U6a’，所述引物序列为：B1’-M：5’-caacgcttctgtttcgcaagGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’，B2-M：5’-cgagcccaagacactcctctGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’，B2’-M：5’-agaggagtgtcttgggctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’，BL-M：5’-TCGATGTTGACGAAGCGAGTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3’，U3’：5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAcaacgcttctgtttcgcaag-3’，U6a’：5’-AGCGTGggtctcGaccgACGCGTTCGATGTTGACGAAGCGAGT-3’；PCR1:将靶点序列引入到启动子的下游和gRNA序列的上游，此轮PCR包括四个PCR反应；PCR2:将启动子片段和gRNA片段连接在一起，得到U3表达盒和U6a表达盒，此轮PCR包括两个PCR反应；PCR3:将U3和U6a表达盒产物连接起来，同时使U3片段的5’端和U6a片段的3’端带上BsaⅠ酶切位点，此轮PCR包括一个PCR反应。进一步地，在利用U3表达盒与U6a表达盒连接的构造工序前，还具有对质粒的定点工序。进一步地，每完成一个反应体系进行一次电泳检测。进一步地，所述限制性内切酶为KODFX高保真酶。进一步地，基于U3表达盒和U6a连接生成的产物与MH质粒连接的重组工序为对U3表达盒与U6a表达盒连接的产物进行纯化，再通过酶切使U3表达盒与U6a表达盒连接的产物与MH质粒分别露出互补的粘性末端，酶切后再利用天根通用型DNA纯化回收试剂盒对U3表达盒与U6a表达盒连接的产物与MH质粒进行纯化，最后通过T4连接酶将露出互补粘性末端的U3表达盒与U6a表达盒连接的产物和MH质粒连接起来。进一步地，所述酶切为通过BsaⅠ限制性内切酶进行双酶切。进一步地，在重组后的产物导入到大肠杆菌中的工序后，还需利用菌落PCR鉴定阳性克隆。进一步地，位于PCR1反应体系中的上下游引物，所述引物序列分别为：U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’gRNA-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’。本专利技术的有益效果：本专利技术在PCR2后添加了一轮将U3和U6a的gRNA表达盒连接的PCR反应，然后再进行酶切连接，得到重组质粒；其中，先对U3表达盒与U6a表达盒连接，连接后的产物再与MH质粒连接，相对于现有技术同时将U3表达盒、U6a表达盒、MH质粒一起连接，本专利技术连接的难度远低于现有技术的连接难度，阳性克隆的比例大大增加，实现上述U3表达盒和U6a表达盒连接，重新设计了U3表达盒的下引物B2-M和U6a表达盒的上引物B2’-M，使B2-M与B2’-M的序列部分互补，这样可以使U3表达盒和U6a表达盒产物在第三轮PCR反应中通过碱基互补连接起来；现有技术的多靶点CRISPR/Cas9基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于，该方法包括：/n利用U

【技术特征摘要】
1.一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于，该方法包括：
利用U3表达盒与U6a表达盒连接的构造工序、基于U3表达盒和U6a连接生成的产物与MH质粒连接的重组工序以及重组后的产物导入到大肠杆菌中的工序，其中，利用U3表达盒与U6a表达盒连接的构造工序的具体步骤为：
采用OverlappingPCR法分别得到U3表达盒SEQIDNO：2片段和U6a表达盒SEQIDNO：3片段,并将U3表达盒和U6a表达盒连接起来。包括OverlappingPCR法的三个反应体系：PCR1、PCR2、PCR3，PCR1的上下游引物分别为：U-F、gRNA-R；PCR2的上游引物为B1’-M、B2’-M，下游引物为B2-M、BL-M；PCR3的引物为U3’、U6a’，所述引物序列为：
B1’-M：5’-caacgcttctgtttcgcaagGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’，
B2-M：5’-cgagcccaagacactcctctGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’，
B2’-M：5’-agaggagtgtcttgggctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’，
BL-M：5’-TCGATGTTGACGAAGCGAGTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3’，
U3’：5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAcaacgcttctgtttcgcaag-3’，
U6a’：5’-AGCGTGggtctcGaccgACGCGTTCGATGTTGACGAAGCGAGT-3’；
PCR1:将靶点序列引入到启动子的下游和gRNA序列的上游，此轮PCR包括四个PCR反应；
PCR2:将启动子片段和gRNA片段连接在一起，得到U3表达盒和U6a表达盒，此轮PCR包括两个PCR反应；
PCR3:将U3和U6a表达盒产物连接起来，同时使U3片段的5’端和U6a片段的3’端带上...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨素，朱诚，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33