遗传修饰植物的再生制造技术

本发明专利技术涉及植物育种领域，特别是涉及从细胞和其它组织产生植物。更特别地，本发明专利技术提供了用于改善植物再生的方法和工具，特别是从转化的或遗传修饰的植物细胞中再生。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】遗传修饰植物的再生本专利技术涉及植物育种和生物
，并且特别涉及从细胞和其他组织产生植物。更特别地，本专利技术提供了用于改善植物再生，特别是从转化的或遗传修饰的植物细胞中再生的方法和工具。在植物育种中，为了产生用于特定目的所需基因型和表型，从人类文明的开始临近就已经实践了植物物种的操作过程。随着基因工程的发展，这个农业领域在过去的几十年中已经有了显著的变化。已经开发了多种植物遗传工程方法。转化方法的选择取决于许多变量，主要是待转化的植物物种、实验目的和必要设备的可用性。绝大多数植物转化技术需要使用具有高再生能力的外植体作为起始材料。此外，基因编辑构成了一种新的分子生物学方法，通过该方法可以将特定的修饰如插入、缺失或点突变或其组合引入植物基因组中。为此，需要特异性分子仪器，其首先具有核酸酶活性，但最重要的是可以以足够的特异性引导至待修饰的靶序列，以编程和进行特异性和定点诱变。在过去的几年中，在植物生物技术中，特异性基因组编辑已经发展为常规育种和转基因策略的替代。然而，由于植物的经编辑起始材料的有限再生能力，目前可用的工具，例如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFNs)、"转录激活剂样效应物核酸酶"(TALEN)或CRISPR系统仅在有限程度上用于植物生物技术中。多种细胞具有发育为胚胎的潜力，包括单倍体配子体细胞，例如花粉和胚囊的细胞(参见Forster,B.P.,等人(2007)TrendsPlantSci.12:368-375andSeguí-Simarro,J.M.(2010)Bot.Rev.76:377-404)，以及衍生自植物的所有三个基本组织层的体细胞(Gaj,M.D.(2004)PlantGrowthRegul.43:27-47或Rose,R.,等人(2010)“Developmentalbiologyofsomaticembryogenesis”in:PlantDevelopmentalBiology-BiotechnologicalPerspectives,PuaE-C和DaveyMR,编著(BerlinHeidelberg:Springer),pp.3-26)。再生成植物的能力通常限于某些植物物种中的特定基因型，并且在转化和遗传修饰的植物细胞和其它前体组织中减弱。即使转化和遗传修饰植物细胞的步骤是成功的，这也不一定意味着实际上可以从修饰的细胞获得期望的植物。据推测，植物细胞和其它前体组织为了实现遗传修饰而经受的处理影响植物发育和再生。因此，本专利技术的目的是提高先前已知的用于产生转基因和遗传修饰植物的方法的功效，并支持从修饰的植物细胞和其它植物前体再生植物。在本专利技术中，令人惊奇地发现拟南芥属基因GRF5(GROWTH-REGULATINGFACTOR5，生长调节因子5)在促进植物再生中具有作用，这并未针对这种基因或其GRF基因家族的对应物而被报道过。在vanderKnaap等人(2000；“Anovelgibberellin-inducedgenefromriceanditspotentialregulatoryroleinstemgrowth”,Plantphysiology,122(3),695-704.)中，作者鉴定并表征了GRF基因家族在稻中的第一个成员(OsGRF1)这是居间分生组织中赤霉酸诱导的基因。拟南芥属中的过表达导致茎生长受损、雌性不育和雄性育性降低。赤霉酸的应用不能恢复转化植物的茎伸长缺陷，表明OsGRF1能参与GA诱导的茎伸长。2003Kim等人(“TheAtGRFfamilyofputativetranscriptionfactorsisinvolvedinleafandcotyledongrowthinArabidopsis”,ThePlantJournal,36(1),94-104.)中已经表征了拟南芥属GRF家族，并确定了这些基因主要在活跃生长的组织中表达。对过表达AtGRF1和AtGRF2的无效突变体和转基因植物的分析表明GRF家族的一些成员参与了叶和子叶生长过程中细胞扩增的调节。此外，过表达的植物显示延迟的抽苔时间，揭示了开花中的推定作用。在确定协调发育叶中细胞增殖的分子机制的研究中，Rodriguez等发现miR396拮抗其靶标GRF转录因子在拟南芥属中的表达模式((2010),“ControlofcellproliferationinArabidopsisthalianabymicroRNAmiR396”,Development,137(1),103-112.)。因此，miR396和GRF之间的平衡控制叶中细胞的最终数目。此外，作者显示靶向miR396的GRF可调节茎顶端分生组织的大小。2005年，Horiguchietal.(“ThetranscriptionfactorAtGRF5andthetranscriptioncoactivatorAN3regulatecellproliferationinleafprimordiaofArabidopsisthaliana”,ThePlantJournal,43(1),68-78.)首次表征了AtGRF5及其相互作用配偶体ANGUSTIFOLIA3(AN3)。敲除突变体atgrf5和an3由于细胞数目减少而产生狭窄的叶，而在AtGRF5和AN3过表达株系中叶原基中的细胞增殖增强。Kuijt等人((2014),的细胞增殖增强。)“ThetranscriptionfactorAtGRF5andthetranscriptioncoactivatorAN3regulatecellproliferationinleafprimordiaofArabidopsisthaliana”,显示GRF家族在网络中作用为参与者控制KNOTTED1-LIKEHOMEBOX(KNOX)基因的表达，其参与枝条芽顶端分生组织的细胞分化限制。AtGRF4、AtGRF5和AtGRF6能够结合KNOX基因的启动子，抑制其表达。过表达AtGRF4、AtGRF5或AtGRF6的拟南芥幼苗在芽顶端分生组织中表现出发育异常。在Vercruyssen等人((2015),n。过表达组织的细gulatingfactor5stimulatesArabidopsischloroplastdivision,photosynthesis,andleaflongevity”,Plantphysiology,pp-114.)的最近研究中，过量表达GRF5的拟南芥属叶显示了每个细胞更高的叶绿体数目、增加的叶绿素含量和延迟的叶衰老。总之，众所周知拟南芥属基因AtGRF5和其它GRF基因在叶片形态发生和茎发育中起作用。此外，据报道GRF基因在开花、种子和根发育中起作用，以控制胁迫条件下的植物生长和调节植物寿命。然而，在他们的研究过程中，本专利技术的专利技术人惊奇地发现了该基因家族的另一和新的功能。GRF5能够提供加强植物再生的积极作用，因此允许更有效地回收转基因植物。本专利技术允许改善来自不同组织或细胞(例如小孢子)的再生，可以克服对植物再生的不顺应性，特别是基因型依赖性，通过例如目的基因和GRF5的共表达改善转基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转化植物细胞的方法，包括以下步骤/n(a1)平行或顺序地将以下引入植物细胞/ni.至少一种目的核苷酸序列；以及/nii.包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒、编码GRF5多肽的mRNA或GRF5多肽；或/n(a2)将至少一种目的核苷酸序列引入植物细胞；以及/n在所述植物细胞中平行或顺序诱导编码GRF5多肽的内源基因的增强的表达水平；以及/n(b)任选地，在一定条件下培养(a1)或(a2)的植物细胞或衍生自(a1)或(a2)的植物细胞的植物细胞，在所述条件中在所述植物细胞中，GRF5多肽由表达盒表达，GRF5多肽由引入的mRNA翻译，GRF5多肽由内源基因增强表达，或存在GRF5多肽。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180103 EP 18150187.51.一种转化植物细胞的方法，包括以下步骤
(a1)平行或顺序地将以下引入植物细胞
i.至少一种目的核苷酸序列；以及
ii.包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒、编码GRF5多肽的mRNA或GRF5多肽；或
(a2)将至少一种目的核苷酸序列引入植物细胞；以及
在所述植物细胞中平行或顺序诱导编码GRF5多肽的内源基因的增强的表达水平；以及
(b)任选地，在一定条件下培养(a1)或(a2)的植物细胞或衍生自(a1)或(a2)的植物细胞的植物细胞，在所述条件中在所述植物细胞中，GRF5多肽由表达盒表达，GRF5多肽由引入的mRNA翻译，GRF5多肽由内源基因增强表达，或存在GRF5多肽。


2.修饰植物细胞基因组的方法，包括步骤
(a1)将如下引入植物细胞：包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒、编码GRF5多肽的mRNA或GRF5多肽；或
(a2)在植物细胞中诱导编码GRF5多肽的内源基因的增强的表达水平；以及
(b)在一定条件下培养(a1)或(a2)的植物细胞或衍生自(a1)或(a2)的植物细胞的植物细胞，在所述条件中在所述植物细胞中，GRF5多肽由表达盒表达，GRF5多肽由引入的mRNA翻译，GRF5多肽由内源基因增强表达，或存在GRF5多肽；
(c)通过双链DNA断裂(DSB)诱导酶和任选地通过修复核酸分子修饰(b)的植物细胞的基因组，所述诱导酶，所述酶优选地识别所述细胞的基因组中的预定位点，
其中在所述预定位点的所述基因组的修饰选自
i.至少一个核苷酸的置换；
ii.至少一个核苷酸的缺失；
iii.至少一个核苷酸的插入；或
iv.i-iii的任何组合；以及
其中步骤(c)与步骤(a1)/(a2)和/或(b)同时进行，在步骤(a1)/(a2)之前进行，在步骤(a1)/(a2)和(b)之间进行或在步骤(b)之后进行。


3.一种产生转基因植物的方法，包括步骤
(a)根据权利要求1的方法转化植物细胞，和
(b)从(a)的植物细胞或从(a)的植物细胞衍生的植物细胞再生包含至少一个细胞的植物，所述细胞包含作为转基因的至少一个目的核苷酸序列。


4.一种产生遗传修饰植物的方法，包括步骤
(a)根据权利要求2的方法修饰植物细胞的基因组，和
(b)从(a)的植物细胞或从衍生自(a)的植物细胞再生在至少一个细胞中包含基因组修饰的植物。


5.产生单倍体植物胚的方法，包括步骤
(a1)将如下引入未成熟雄配子体或小孢子中：包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒、编码GRF5多肽的mRNA或GRF5多肽的mRNA；或
(a2)在未成熟雄配子体或小孢子中诱导编码GRF5多肽的内源基因的增强的表达水平；以及
(c)在一定条件下培养(a)的未成熟雄配子体或小孢子，其中在未成熟雄配子体或小孢子中，GRF5多肽从表达盒表达，GRF5多肽从引入的mRNA翻译，GRF5多肽从内源基因增强表达，或存在GRF5多肽；以及
(d)选择来源于步骤(b)的未成熟雄性配子体或小孢子的单倍体植物胚。


6.权利要求1至5任一项的方法，其中所述GRF5多肽包含PFAM结构域PF08880和PFAM结构域...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·帕切科维拉洛博斯，W·科赫，B·波莱特，O·施米茨，孔吉祥，S·马丁奥尔提戈斯，
申请(专利权)人：科沃施萨特有限及两合公司，巴斯夫欧洲公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE