一种温郁金毛状根的诱导方法技术

本发明专利技术公开了一种温郁金毛状根的诱导方法，包括以下步骤：1）侵染液的制备；2）活体组培苗的培养；3）毛状根的诱导；4）毛状根的脱菌培养及繁殖。本发明专利技术首先利用温郁金的内生菌侵染组培苗，作为发根农杆菌的受体，再利用发根农杆菌活体侵染温郁金活体组培苗的茎段，实现高效诱导出毛状根，为利用温郁金毛状根诱导体系生长药用成分提供技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种温郁金毛状根的诱导方法
本专利技术属于组培快繁
，具体涉及一种温郁金毛状根的诱导方法。
技术介绍
温郁金（CurcumawenyujinY.H.ChenetC.Ling）是姜科姜黄属植物，主要分布于浙江省的温州地区，全株均可供药用。其块根加工成的药材“温郁金”为浙江省著名道地药材“浙八味”之一。根据药用部位与加工方法的不同，温郁金植物体的地下根茎可分别加工成3种不同药材：块根煮熟晒干称“温郁金”，侧根茎纵切厚片晒干称“片姜黄”，主根茎煮熟晒干称“温莪术”。3种药材均为2010年版《中国药典》收载品种，具有极高的经济价值。在温郁金的化学成分研究方面，迄今为止，已从其中分离得到82种化学成分，主要类型有单萜类、倍半萜类、二萜类、生物碱及其他成分。在温郁金药理活性研究方面，现代药理学研究表明，温郁金中含有抗肿瘤的活性物质，包括蓬莪术环二烯、β-榄香烯、δ-榄香烯等。蓬莪术二烯，作为温郁金根茎挥发油的主要成分之一，对肿瘤细胞具有抑制作用。特别是近年来研究发现，从温郁金中分离的β-榄香烯表现出高效低毒的抗肿瘤活性，药理研究证实β-榄香烯对肺癌、肝癌、脑癌、食道癌、胃癌和骨转移癌等多种癌症安全有效，具有增加诱导细胞凋亡的作用。据此已研制出疗效好、副作用小的新型抗肿瘤药物，开发出具有我国自主知识产权的抗肿瘤植物药物。并且，温郁金在抗炎、镇痛方面具有显著疗效，还具有保肝、抗忧郁作用、抗血栓和改善血液循环等功效。另一方面，毛状根（hairyroots）是发根农杆菌所含Ri质粒的T-DNA片段在植物细胞基因组中插入、整合并表达，诱导植物细胞形成的不定根。毛状根在形态上保持了植物原根系统的特征，在生理上具有原根系统完整的代谢通路；毛状根起源于单细胞而不存在嵌合体，在遗传上具有高度的稳定性和一致性。在应用上，由于毛状根具有天然根的结构、能够在不含有植物激素的培养基上快速生长、且遗传稳定性高并能合成和积累次生代谢物质，因此，毛状根可作为生物反应器生产药用植物的药用活性成分。因此，诱导出温郁金的毛状根，具有重要的实践价值。本专利技术目的是提供一种诱导温郁金毛状根的高效诱导的方法，克服目前根系药用植物产量少、培养难的问题，以便利用毛状根生产温郁金的药用成分。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术设计的目的在于提供一种诱导温郁金毛状根的技术方案。本专利技术通过以下技术方案加以实现：所述的一种温郁金毛状根的诱导方法，其特征在于包括以下步骤：1）侵染液的制备分别取-80℃保存的野生型的发根农杆菌K599及-80℃保存的温郁金内生菌WYJ-E13，经活化与培养后分别制得发根农杆菌侵染液和内生菌侵染液，待用；2）活体组培苗的培养于200mL的培养瓶中，加入MS(0)固体培养基50mL，在培养基中接入高1-2cm的组培苗，在培养瓶中接入组培苗后，随即用加样枪吸取5-10μL的内生菌侵染液，加到组培苗基部的培养基表面；3）毛状根的诱导经步骤2）处理的组培苗与内生菌侵染液共培养15天，然后用无菌剪刀在距离组培苗根部0.5-1cm的茎处，剪除组培苗上部，仅留组培苗0.5-1cm的茎和根，用微量加样枪吸收发根农杆菌侵染液2-5μL直接滴加到组培苗茎的剪切口处，随后将侵染后的组培苗于28℃的温度条件下遮光培养15-30天，在组培苗的剪切口上部得到毛状根；4）毛状根的脱菌培养及繁殖待诱导出的毛状根长至3cm以上时，剪下毛状根并接种到含500mg/LCef（头孢霉素）的MS培养基上，每20d继代1次，经过3次继代完全灭杀农杆菌后，转入MS培养基培育繁殖毛状根。所述的一种温郁金毛状根的诱导方法，其特征在于步骤1）中发根农杆菌侵染液的制备，具体为将-80℃保存的野生型的发根农杆菌K599在含有50mg/LStr（链霉素）的LB培养基上划线培养；取培养后的单菌落于含有50mg/LStr的LB液体培养基中过夜培养，当农杆菌生长到菌液OD值约为1.0时，取1mL菌液于1.5mL离心管中，离心、除上清；用MS液体培养基悬浮菌体，离心、除上清；再用MS液体培养基稀释至OD值约为0.1，用作农杆菌侵染液。所述的一种温郁金毛状根的诱导方法，其特征在于步骤1）中内生菌侵染液的制备，具体为将-80℃保存的温郁金内生菌WYJ-E13在含有50mg/LStr的PDA培养基上划线培养，取培养后的单菌落于含有50mg/LStr的PDA液体培养基中过夜培养，当内生菌的菌液OD值约为1.0时，取1mL菌液于1.5mL离心管中，离心、除上清；用MS液体培养基悬浮菌体，离心、除上清；再用MS液体培养基稀释至OD值约为0.01，用作内生菌侵染液。所述的一种温郁金毛状根的诱导方法，其特征在于各培养均于28℃的温度条件下进行，且200r/min的条件下摇床培养。本专利技术首先利用温郁金的内生菌侵染组培苗，作为发根农杆菌的受体，再利用发根农杆菌活体侵染温郁金活体组培苗的茎段，实现高效诱导出毛状根，为温郁金毛状根诱导体系提供技术支撑。附图说明图1为不同组培苗茎上诱导毛状根；图2为对比叶片侵染未能诱导出毛状根；图3为对比离体茎段诱导毛状根；图4为毛状根的PCR鉴定，图中，M：DNA标准分子量；1：普通组培苗的根；2和3：从离体茎诱导出的毛状根；4和5：从活体组培苗茎上诱导的毛状根；箭头所指：为扩增的条带。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术做进一步详细描述。实施例1、诱导毛状根侵染液的制备1）农杆菌侵染液的制备：将-80℃保存的野生型的发根农杆菌K599在含有50mg/LStr的LB培养基上划线培养，28℃；取培养后的单菌落于含有50mg/LStr的LB液体培养基中过夜培养，当农杆菌生长到菌液OD值约为1.0时，取1mL菌液于1.5mL离心管中，离心、除上清；用MS液体培养基悬浮菌体，离心、除上清；再用MS液体培养基稀释至OD值为约0.1，用作农杆菌侵染液。2）内生菌侵染液的制备将-80℃保存的温郁金内生菌WYJ-E13在含有50mg/LStr的PDA培养基上划线培养，28℃；取培养后的单菌落于含有50mg/LStr的PDA液体培养基中过夜培养，28℃、200r/min，当内生菌的菌液OD值约为1.0时，取1mL菌液于1.5mL离心管中，离心、除上清；用MS液体培养基悬浮菌体，离心、除上清；再用MS液体培养基稀释至OD值约为0.01，用作内生菌侵染液。2、活体组培苗的培养于200mL的培养瓶中，加入MS(0)固体培养基50mL，在培养基中接入高1-2cm的组培苗，在培养瓶中接入组培苗后，随即用加样枪吸取5-10μL的内生菌侵染液，加到组培苗基部的培养基表面；MS(0)固体培养基为不添加任何激素的MS培养基。3、毛状根的诱导将经过内生菌侵染的组培苗与内生菌侵染液共培养15天，然后用无菌剪刀在距离组培苗根部0.5-1cm的茎处，剪除组培苗上部，仅留本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种温郁金毛状根的诱导方法，其特征在于包括以下步骤：/n1）侵染液的制备/n分别取-80℃保存的野生型的发根农杆菌K599及-80℃保存的温郁金内生菌WYJ-E13，经活化与培养后分别制得发根农杆菌侵染液和内生菌侵染液，待用；/n2）活体组培苗的培养/n于200mL的培养瓶中，加入MS(0)固体培养基50mL，在培养基中接入高1-2cm的组培苗，在培养瓶中接入组培苗后，随即用加样枪吸取5-10μL的内生菌侵染液，加到组培苗基部的培养基表面；/n3）毛状根的诱导/n经步骤2）处理的组培苗与内生菌侵染液共培养15天，然后用无菌剪刀在距离组培苗根部0.5-1cm的茎处，剪除组培苗上部，仅留组培苗0.5-1cm的茎和根，用微量加样枪吸收发根农杆菌侵染液2-5μL直接滴加到组培苗茎的剪切口处，随后将侵染后的组培苗于28℃的温度条件下遮光培养15-30天，在组培苗的剪切口上部得到毛状根；/n4）毛状根的脱菌培养及繁殖/n待诱导出的毛状根长至3cm以上时，剪下毛状根并接种到含500 mg/LCef的MS培养基上，每20 d继代1次，经过3次继代完全灭杀农杆菌后，转入MS培养基培育繁殖毛状根。/n

【技术特征摘要】
1.一种温郁金毛状根的诱导方法，其特征在于包括以下步骤：
1）侵染液的制备
分别取-80℃保存的野生型的发根农杆菌K599及-80℃保存的温郁金内生菌WYJ-E13，经活化与培养后分别制得发根农杆菌侵染液和内生菌侵染液，待用；
2）活体组培苗的培养
于200mL的培养瓶中，加入MS(0)固体培养基50mL，在培养基中接入高1-2cm的组培苗，在培养瓶中接入组培苗后，随即用加样枪吸取5-10μL的内生菌侵染液，加到组培苗基部的培养基表面；
3）毛状根的诱导
经步骤2）处理的组培苗与内生菌侵染液共培养15天，然后用无菌剪刀在距离组培苗根部0.5-1cm的茎处，剪除组培苗上部，仅留组培苗0.5-1cm的茎和根，用微量加样枪吸收发根农杆菌侵染液2-5μL直接滴加到组培苗茎的剪切口处，随后将侵染后的组培苗于28℃的温度条件下遮光培养15-30天，在组培苗的剪切口上部得到毛状根；
4）毛状根的脱菌培养及繁殖
待诱导出的毛状根长至3cm以上时，剪下毛状根并接种到含500mg/LCef的MS培养基上，每20d继代1次，经过3次继代完全灭杀农杆菌后，转入MS培养基培育繁殖毛状根。


2.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐正贤，向太和，江洁，罗灶霞，李江山，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33