分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株及其分泌的抗体和一种免疫层析检测卡制造技术

本发明专利技术提供了分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株及其分泌的抗体和一种免疫层析检测卡。该细胞株的分类命名为抗黄曲霉素杂交瘤细胞株8B11，保藏编号为CCTCC NO：C2019314，保藏日期为2019年12月4日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学。本发明专利技术提供的分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株8B11分泌的抗体可以高亲和力结合并同时识别《中国药典》规定的四种黄曲霉毒素主要亚型，即B1、B2、G1、G2，为开发总黄曲霉毒素快速检测产品提供基础。此外，本发明专利技术提供一种方便、快速的中药材前处理方法，配套基于抗原抗体反应的免疫层析检测卡，用于中药材黄曲霉毒素快速检测，具有快速、方便、低成本的优点，可大规模推广。

【技术实现步骤摘要】
分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株及其分泌的抗体和一种免疫层析检测卡
本专利技术涉及抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的杂交瘤细胞株领域，具体涉及分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株及其分泌的抗体和一种免疫层析检测卡。
技术介绍
黄曲霉毒素(AFT)是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物，有约20种，分别命名为B1、B2、G1、G2、M1、M2、GM、P1、Q1、毒醇等。黄曲霉毒素是主要由黄曲霉(aspergillusflavus)和寄生曲霉(a.parasiticus)产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。它们存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品。2017年世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中黄曲霉毒素位列一类致癌物，是毒性极强的剧毒物质，其中以B1的毒性最大，致癌性最强。动物食用黄曲霉毒素污染的饲料后，在肝、肾、肌肉、血、奶及蛋中可测出极微量的毒素。黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1简写为AFB1)是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。在天然食物中以黄曲霉毒素B1最为多见，危害性也最强，国家质检总局规定黄曲霉毒素B1是大部分食品的必检项目之一。在中药领域里，2015版《中国药典》规定黄曲霉毒素检查有19种中药材，相对2010版《中国药典》增加了14个品种，具体包括：远志、大枣、肉豆蔻、决明子、麦芽、陈皮、使君子、柏子仁、胖大海、莲子、桃仁、槟榔、酸枣仁、薏苡仁、水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣、僵蚕。要求黄曲霉毒素B1不得超过5μg/kg；黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2总量不得超过10μg/kg。荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。对于只具有单一抗原表位的小分子抗原(农兽药、违禁药物等)，待测小分子抗原与荧光标记抗体结合后，由于空间位阻作用难以再与检测线上的包被抗体结合。所以，具有单一抗原表位的小分子待测物多采用竞争免疫层析法检测。荧光免疫层析分析技术，非常适宜被用于黄曲霉毒素的检测，荧光免疫层析分析方法具有灵敏度高、稳定性好、成本低、速度快、受自然荧光干扰低等优点，成为食品质量安全快速检测分析研究的热点，是一种易于现场即时使用的检测技术。目前，用于荧光免疫分析的标记物主要包括荧光素、量子点、上转换纳米粒子等。基于荧光免疫层析方法开发的检测产品的核心是特异性识别黄曲霉毒素的单克隆抗体，该抗体的结合灵敏度和特异性决定了检测试剂盒的质量，因此好的黄曲霉毒素单克隆抗体的研制是该类检测试剂盒开发的关键前提。目前市场广泛存在的检测黄曲霉毒素的快速检测产品均为检测黄曲霉毒素B1的胶体金或荧光免疫层析检测卡。其所用单克隆抗体试剂特异性识别黄曲霉毒素B1亚型，对其他亚型没有识别性。但是若要开发检测总黄曲霉毒素，即包含B1、B2、G1、G2四种黄曲霉毒素亚型的快速检测产品，则需要首先获得能够同时识别四种黄曲霉毒素的单克隆抗体试剂，并且对中药材进行前处理，其目的是将中药材中的黄曲霉毒素快速、充分的溶解于适宜抗体试剂结合的中性液相介质中。目前《药典》规定的黄曲霉毒素前处理方法为：“取供试品粉末约15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70％甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟(搅拌速度大于11000转/分钟)，离心5分钟(离心速度2500转/分钟)，精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。(2015版《中国药典》)”。该方法是配合后续液相色谱检测所开发，不适用于配套免疫层析快速检测方法。主要问题是：1.最终检测样本中甲醇含量过高，影响抗原抗体结合反应；2.采用了免疫亲和柱净化，虽然去掉了大量可能影响色谱检测的杂质，但是提高了检测成本，增加了处理步骤和处理时间；3.处理过程耗时长，较为繁琐。综上所述，目前对中药材黄曲霉毒素进行快速检测，需要一种同时识别四种黄曲霉毒素的单克隆抗体和适用于配套免疫层析快速检测方法的中药材前处理方法。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术的缺陷，提供分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株及其分泌的抗体和一种免疫层析检测卡。通过构建杂交瘤细胞株、单克隆抗体的纯化产生抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2四种亚型的单克隆抗体，并且基于此，制备一种免疫层析检测卡，实现对中药材的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2四种亚型的快速检测。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个方面是提供分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株，其分类命名为抗黄曲霉素杂交瘤细胞株8B11，保藏编号为CCTCCNO：C2019314，保藏日期为2019年12月4日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学。本专利技术的第二个方面是提供上述分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株分泌的抗体，该抗体的制备方法包括如下步骤：步骤一，动物免疫：用黄曲霉毒素B1半抗原与免疫佐剂混合，乳化后，对实验动物皮下注射进行免疫；三次免疫后，将黄曲霉毒素B1半抗原溶于PBS缓冲液，然后腹腔注射进行回忆刺激；步骤二，杂交瘤细胞株的构建：将骨髓瘤细胞与脾细胞按比例混合，然后在室温加入预热的融合剂进行融合，融合后的细胞经处理后放置培养箱中进行培养，得到分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株；步骤三，利用有限稀释法对杂交瘤细胞株进行单克隆化；步骤四，生产抗体：给注射了降植烷的实验动物接种杂交瘤细胞，接种8-12天后，腹腔抽取含有抗体的腹水；步骤五，纯化抗体。进一步地，步骤一中黄曲霉毒素B1半抗原的注射剂量为0.1mg/次/只。进一步地，步骤二中骨髓瘤细胞处于对数生长期。进一步地，步骤二中骨髓瘤细胞与脾细胞的比例为1:10或1:5。进一步地，步骤二中的融合剂为含5％DMSO的浓度为45％的聚乙二醇(PEG)溶液，融合的时间为60-120s。进一步地，抗体纯化的具体步骤为：(1)抽取的腹水用冷PBS溶液稀释后，离心、去沉淀；(2)在4℃下，向上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，直至使上清液中硫酸铵的浓度为50％；(3)将处理后的上清液置冰中30min～60min，然后离心、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株，其特征在于，其分类命名为抗黄曲霉素杂交瘤细胞株8B11，保藏编号为CCTCC NO：C2019314，保藏日期为2019年12月4日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学。/n

【技术特征摘要】
1.分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株，其特征在于，其分类命名为抗黄曲霉素杂交瘤细胞株8B11，保藏编号为CCTCCNO：C2019314，保藏日期为2019年12月4日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学。


2.一种如权利要求1所述分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株分泌的抗体，其特征在于，采用以下步骤制备：
步骤一，动物免疫：用黄曲霉毒素B1半抗原与免疫佐剂混合，乳化后，对实验动物皮下注射进行免疫；三次免疫后，将黄曲霉毒素B1半抗原溶于PBS缓冲液，然后腹腔注射进行回忆刺激；
步骤二，杂交瘤细胞株的构建：将骨髓瘤细胞与脾细胞按比例混合，然后在室温加入预热的融合剂进行融合，融合后的细胞经处理后放置培养箱中进行培养，得到所述分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株；
步骤三，利用有限稀释法对所述杂交瘤细胞株进行单克隆化；
步骤四，生产抗体：给注射了降植烷的实验动物接种所述杂交瘤细胞株，接种8-12天后，腹腔抽取含有抗体的腹水；
步骤五，纯化抗体。


3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，步骤一中所述黄曲霉毒素B1半抗原的注射剂量为0.1mg/次/只。


4.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，步骤二中所述骨髓瘤细胞处于对数生长期。


5.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，步骤二中所述骨髓瘤细胞与脾细胞的比例为1:10或1:5。


6.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，步骤二中所述融合剂为含5％DMSO的浓度为45％的聚乙二醇溶液，融合的时间为60～120s。


7.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体纯化的具体步骤为：
(1)抽取的腹水用冷PBS溶液稀释后，离心、去沉淀；
(2)在4℃下，向上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，直至使上清液中硫酸铵的浓度为50％；
(3)将处理后的上清液置冰中30min～60min，然后离心、去上清，将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液中再进行透析；
(4)透析后，离心去沉淀，然后稀释上清液，通过柱层析法对抗体进行分离纯化。


8.一种免疫层析检测卡，其特征在于，用于对中药...

【专利技术属性】
技术研发人员：边超，姚譞，樊敏伟，
申请(专利权)人：上海中药制药技术有限公司，上海医妙禾桢生物医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31