肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的治疗制造技术

本发明专利技术涉及编码靶向SOD1的多核苷酸的AAV，其可用于治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)和/或犬退行性脊髓病(DM)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的治疗相关申请的交叉引用本申请要求2017年10月16日提交的标题为“肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的治疗”的临时专利申请号62/572,702的权益，其内容通过引用整体并入本文。参考序列表本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以标题为“20571047PCTSL.txt”的文件提供，其创建于2018年10月16日并且大小为93,286个字节。序列表的电子形式的信息通过引用整体并入本文。专利
本专利技术涉及多核苷酸的组合物，设计、制备、制造和/或配制该多核苷酸的方法和工艺，该多核苷酸包括AAV载体、小干扰RNA(siRNA)双链体、shRNA、微RNA或其前体，其靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)基因或编码靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)基因的分子，以干扰SOD1基因表达和/或SOD1酶生产。在一些实施方案中，多核苷酸被插入到重组腺相关病毒(AAV)载体中。还公开了在患有神经退行性疾病的受试者中抑制SOD1基因表达的方法。该方法任选地将至少一种多核苷酸引入患有所述神经退行性疾病的受试者中。特别地，该疾病是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。专利技术背景肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，也称为LouGehrig病，是一种致命的进行性神经退行性疾病，其特征是主要运动皮层、脑干和脊髓中运动神经元(MN)的大量丧失。运动神经元的丧失破坏基本的基础运动，例如呼吸，并且通常会导致患者在诊断后2至5年内死亡。患者中运动功能的逐渐恶化严重破坏他们的呼吸能力，需要某种形式的呼吸辅助来使患者存活。其他症状还包括手、臂、腿或吞咽肌肉的肌无力。一些患者(例如FTD-ALS)也可能发展额颞叶痴呆。根据ALS协会，美国每年约有5,600人被诊断出患有ALS。ALS的发病率是每10万人2例，并且据估计，在任何给定时间，多达30,000名美国人可能患有该病。已经描述了两种形式的ALS：一种是偶发性ALS(sALS)，其是美国最常见的ALS形式，占诊断出的所有病例的90％至95％。另一个是家族性ALS(fALS)，其主要发生在家族谱系中，具有显性遗传，并且仅占美国所有病例的约5％至10％。sALS和fALS在临床上无法区分。病理研究表明，在疾病发作后发生某些细胞过程，包括内质网应激增加、自由基(即活性氧物质(ROS))生成、线粒体功能障碍、蛋白质聚集、细胞凋亡、炎症和谷氨酸兴奋性中毒，特别是在运动神经元(MN)中。ALS的病因复杂且多样。通常，ALS被认为是一种复杂的遗传疾病，其中多个基因与环境暴露的结合使人易感。已发现与ALS相关的超过十几种基因，包括SOD-1(Cu2+/Zn2+超氧化物歧化酶)、TDP-43(TARDBP，TARDNA结合蛋白-43)、FUS(融合于肉瘤/在肉瘤中易位)、ANG(血管生成素)、ATXN2(Ataxin-2)、含缬酪肽的蛋白(VCP)、OPTN(optineurin)和在9号染色体开放阅读框72(C9ORF72)中的非编码GGGGCC六核苷酸重复序列的扩增。但是，运动神经元退化的确切机制仍然难以捉摸。目前，没有针对ALS的治愈性疗法。唯一被FDA批准的药物是利鲁唑，其拮抗谷氨酸反应，以减少ALS的病理发展。然而，仅报道了早期阶段的ALS患者大约有三个月的寿命延长，而在晚期阶段的ALS患者中未观察到治疗益处，这表明患者缺乏治疗选择(BensimonG等人，JNeurol.2002年，249，609-615)。因此，仍然需要能够有效预防该疾病进展的新治疗策略。I型Cu2+/Zn2+超氧化物歧化酶(SOD1)基因的突变是fALS的最常见原因，占所有fALS病例的约20％至30％。最近的报道表明，在所有sALS病例中也有约4％可能与SOD1突变相关联(Robberecht和Philip，Nat.Rev.Neurosci.,2013，14，248-264)。与SOD1关联的fALS十分可能不是由正常SOD1活性的丧失引起，而是由毒性功能的获得引起。与突变SOD1关联的fALS毒性的假说之一提出，异常的SOD1酶导致小分子，例如过氧亚硝酸盐或过氧化氢产生破坏性自由基。突变SOD1神经毒性的其他假说包括蛋白酶体活性的抑制、线粒体损伤、RNA加工的破坏和细胞内聚集物的形成。ALS中突变型SOD1变体和/或野生型SOD1的异常积累形成被识别为病理包涵体的不溶性纤维状聚集体。聚集的SOD1蛋白可诱导线粒体应激(VehvilainenP等人，FrontCellNeurosci.，2014，8，126)和对细胞特别是对运动神经元的其他毒性。这些发现表明，SOD1可能是家族性和偶发性ALS的潜在治疗靶标。可以减少ALS患者中枢神经系统中产生的SOD1蛋白(无论是野生型还是突变型)的疗法可能减轻患者的ALS症状，例如运动神经元退化、肌无力和萎缩。旨在防止野生型和/或突变型SOD1蛋白聚集的试剂和方法可预防疾病进展并改善ALS症状。RNA干扰(RNAi)介导的基因沉默近年来引起了研究人员的兴趣。本领域已经教导了靶向SOD1基因的小双链RNA(小干扰RNA)分子在治疗ALS方面的潜力(参见，例如，美国专利号7,632,938和美国专利公开号20060229268)。本专利技术开发了一种基于RNA干扰或敲低的方法来抑制或预防ALS患者中SOD1基因的表达，以治疗该疾病。本专利技术提供了新的多核苷酸，包括双链RNA(dsRNA)构建体和/或siRNA构建体、shRNA构建体和/或microRNA构建体及其设计方法。另外，这些siRNA构建体可以是在用于递送至细胞中的表达载体(一条或两条链)中编码的合成分子。此类载体包括但不限于腺相关病毒载体，例如任何AAV血清型的载体基因组或其他病毒递送载体，例如慢病毒等。
技术实现思路
本专利技术提供了编码靶向SOD1的多核苷酸以干扰SOD1基因表达和/或SOD1蛋白生产的AAV载体及其使用方法。本专利技术还包括治疗运动神经元退行性疾病如肌萎缩性侧索硬化症的方法。在一个实施方案中，与未治疗的受试者相比，在用编码靶向SOD1的多核苷酸的AAV治疗的受试者中SOD1被抑制30％。可以以预定剂量水平以输注或推注(bolus)的形式给受试者施用AAV。作为非限制性实例，在C1至L7腹角区域中见到抑制。本专利技术涉及RNA分子介导的对基因表达和蛋白生产的基因特异性干扰。本专利技术还包括治疗运动神经元退行性疾病如肌萎缩性侧索硬化症的方法。本文中特征性的组合物中包括的siRNA包含具有反义链(反义链)的dsRNA，该反义链具有长度为30个核苷酸或更少，通常19-24个核苷酸，且与SOD1基因的mRNA转录本的至少一部分基本互补的区域。本专利技术提供靶向SOD1mRNA以干扰SOD1基因表达和/或SOD1蛋白生产的短双链RNA分子，例如小干扰RNA(siRNA)双链体。本专利技术的siRNA双链体可以干扰SOD1基因的两个等位基因，而不论SOD1基因中的任何具体突变为何，并且可以特别地与在ALS疾病中发现的那些相互作用。在一些实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含定位在两个反向末端重复序列(ITR)之间的核酸序列，其中所述核酸序列在表达时抑制或压制细胞中的SOD1表达，其中所述酸序列包含有义链序列和反义链序列，其中所述有义链序列包含至少15个与表3中列出的序列的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的连续核苷酸，并且所述反义链序列包含至少15个与表2中列出的序列的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的连续核苷酸，并且其中所述有义链序列和反义链序列共有长度为至少4个核苷酸的互补性区域。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171016 US 62/572,7021.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含定位在两个反向末端重复序列(ITR)之间的核酸序列，其中所述核酸序列在表达时抑制或压制细胞中的SOD1表达，其中所述酸序列包含有义链序列和反义链序列，其中所述有义链序列包含至少15个与表3中列出的序列的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的连续核苷酸，并且所述反义链序列包含至少15个与表2中列出的序列的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的连续核苷酸，并且其中所述有义链序列和反义链序列共有长度为至少4个核苷酸的互补性区域。


2.根据权利要求1所述的AAV载体，其中所述核酸序列包含siRNA双链体的有义链序列和反义链序列。


3.根据权利要求2所述的AAV载体，其中所述siRNA双链体选自由siRNA双链体IDNo.D-4000至D-4025组成的组。


4.根据权利要求1所述的AAV载体，其中所述互补性区域的长度为至少17个核苷酸。


5.根据权利要求4所述的AAV载体，其中所述互补性区域的长度介于19至21个核苷酸之间。


6.根据权利要求5所述的AAV载体，其中所述互补性区域的长度为19个核苷酸。


7.根据权利要求1所述的AAV载体，其中所述有义链序列和反义链序列独立地为30个核苷酸或更少。


8.根据权利要求1所述的AAV载体，其中所述有义链序列和反义链序列中的至少一个包含至少1个核苷酸的3'悬突。


9.根据权利要求8所述的AAV载体，其中所述有义链序列和反义链序列中的至少一个包含至少2个核苷酸的3'悬突。


10.根据权利要求1所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含选自由以下组成的组的衣壳血清：AAVrh.10、AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8RA586R突变体、AAVrh8RR533A突变体、AAAV、BAAV、羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAVSM10-2、AAV穿梭10...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·WY·沙，陈庆敏，J·R·科茨，H·帕泽克，侯金兆，
申请(专利权)人：沃雅戈治疗公司，密苏里州立大学校董，
类型：发明
国别省市：美国;US