功能性核酸分子及其用途制造技术

公开了一种反式作用功能性核酸分子，其包含真核生物靶结合序列和调节序列，所述真核生物靶结合序列包含与待增强蛋白质翻译的靶mRNA序列反向互补的序列，所述调节序列包含内部核糖体进入位点(IRES)序列或内部核糖体进入位点(IRES)衍生的序列，并增强靶mRNA序列的翻译，其中所述调节序列位于靶结合序列的3'。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】功能性核酸分子及其用途相关申请的交叉引用本申请要求于2017年9月20日提交的意大利专利申请号10201700015372的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
本专利技术涉及具有增强真核生物中特定靶mRNA的蛋白质翻译功能的反式作用的功能性核酸分子、编码此类分子的DNA分子、此类分子的用途以及增强蛋白质翻译的方法。现有技术在真核生物中，mRNA主要通过帽依赖性机制进行翻译，根据所述帽依赖性机制，起始因子将40S核糖体亚基募集到mRNA的5'端的帽结构。但是，一些病毒和细胞信息在没有帽的情况下启动蛋白质合成(ThompsonSR,TrendsMicrobiol2012；JacksonRJ,ColdSpringHarbPerspectBiol.2013)。在这些情况下，称为内部核糖体进入位点(IRES)的结构化RNA元件募集40S核糖体亚基。IRES是20多年前在小核糖核酸病毒中发现的。在细胞中，IRES序列促进非帽依赖性的编码蛋白质的mRNA亚基的翻译，从而克服了在应激条件下发生的帽依赖性翻译的普遍抑制。IRES序列通常存在于编码应激反应基因的细胞mRNA的5'非翻译区，从而刺激其顺式翻译。最近的高通量筛选系统已经扩大了细胞mRNA内验证的IRES序列的列表(Weingarten-GabbayS等人,Science,2016)。可通过修饰编码蛋白质的mRNA，以包括包含内部核糖体进入(IRES)序列或翻译增强子序列的修饰的5'序列，来实现基因特异性翻译的上调。在这样的系统中，IRES或翻译增强子序列被顺式放置在编码感兴趣的特定基因的cDNA的5'端。该方法已用于构建表达两个顺反子的载体，并用于增强过表达基因的翻译。但是，当目标是诱导内源表达的mRNA的翻译上调时，不能使用翻译增强的顺式调节。因此，需要鉴定促进基因特异性翻译上调并作用于内源性mRNA的反式调节元件。还需要作为非依赖性RNA结构域发挥作用的翻译上调反式调节元件。近年来，由于在临床上的潜在应用，使用核酸分子在体内操纵基因表达引起了极大的兴趣。迄今为止，大多数努力都集中在使用siRNA、miRNA和反义寡核苷酸来下调毒性蛋白的能力上。然而，许多疾病是由基因剂量减少引起的，因此需要增加蛋白产物。尽管许多研究已经在转录水平上解决了该问题，但是仅存在一个使用功能性反义RNA分子(SINEUP)来增加翻译的例子(CarrieriC.等人,Nature,2012)。SINEUP是反义、长的非编码RNA，其能够促进部分重叠的编码蛋白质的mRNA的翻译，而对mRNA水平没有影响。SINEUP活性取决于两个功能结构域：重叠区域(或“结合结构域”)，其决定了SINEUP的特异性，而嵌入的反向SINEB2元件则作为“效应子结构域”发挥作用，其控制mRNA翻译的增强(ZucchelliS.等人,FrontCellNeurosci2015；ZucchelliS.等人,RNABiol,2015)。通过利用其模块结构，可以设计合成的SINEUP来特异性增强几乎任何感兴趣靶基因的翻译(ZucchelliS.等人,FrontCellNeurosci2015；ZucchelliS.等人,RNABiol,2015；IndrieriA.等人,ScientificReports,2016；GustincichS.等人,ProgNeurobiol,2016；ZucchelliS.等人,ComputStructBiotechnolJ,2016)。EP2691522公开了包括SINEUP的功能性核酸分子。尽管SINEUP具有潜力，但其仍依赖于嵌入的SINE元件的翻译增强子的活性，SINE元件是源自小鼠基因组的序列，具有在受体细胞中逆转座(从一个基因组位置移动到另一个基因组位置)的潜力。这对于涉及翻译上调以校正基因剂量不足的任何治疗用途都是不利的。因此，需要反式调节元件，其促进基因特异性翻译上调并作用于不是源自小鼠序列的内源性mRNA。还需要反式调节元件，其促进基因特异性翻译上调并且不是源自转座元件。EP2691522的大多数功能性核酸分子具有相当长的长度。需要鉴定较短的反式调节元件，其促进基因特异性翻译上调并作用于内源性mRNA，以使RNA分子向受体细胞更有效地递送。EP2691522的功能性核酸分子的翻译增强作用通常为1.5-2.0倍，这取决于细胞类型。如果目的是在人中诱导翻译上调以校正不足的基因剂量，则这种蛋白增加的水平可能不足。因此，需要鉴定促进更高水平的基因特异性翻译上调并作用于内源性mRNA的反式调节元件。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是提供一种克服上述问题并且可能还具有增强功能的功能性核酸分子。该目的通过权利要求1中所定义的反式作用功能性核酸分子来实现。本专利技术的其他目的是提供权利要求10所定义的DNA分子、权利要求11所定义的表达载体、权利要求12所定义的用于增强蛋白质翻译的方法、权利要求13所定义的组合物以及权利要求14和15所定义的反式作用功能性核酸分子的用途。附图说明图1显示了根据本专利技术的反式作用功能性核酸分子的示意图。图2A显示了根据现有技术(SINEUP)的功能性核酸分子的示意图。图2B显示了在分别用空对照质粒(-)、全长SINEUP-DJ-1(FL)及其缺失突变体(ΔED＝缺失效应子结构域的突变体，ΔBD＝缺失结合结构域的突变体)转染的人胚胎肾293T/17细胞(以下也称为HEK293T/17细胞)的裂解物上进行的蛋白质印迹的结果。图2C显示了qRT-PCR的结果，其定量了在如图2B所示样品上进行的内源性DJ-1mRNA(上图)和SINEUPRNA(下图)的表达。图2D显示了HEK293T/17细胞(N＝5)中全长SINEUP-DJ-1、ΔED和ΔBD对内源性DJ-1mRNA的翻译增强活性的图示。p＜0.05图3显示了靶向DJ-1mRNA的根据本专利技术的通用反式作用功能性核酸分子(IRUP)的示意图。图4显示了用于测试含有IRES的功能性反义核酸分子的翻译上调活性的实验程序的示意图。图5A显示了靶向DJ-1基因并包括HCVIRES的根据本专利技术的功能性核酸分子(IRUP)的示意图。图5B显示了在分别用空对照质粒、SINEUP-DJ-1和在正向(direct)(HCV(d))和反向方向(HCV(i))上包括HCVIRES的IRUP转染的HEK293T/17细胞的裂解物上进行蛋白质印迹的结果。图5C显示了qRT-PCR的结果，其定量了在如图5B所示样品上进行的内源性DJ-1mRNA(上图)和IRUPRNA(下图)的表达。图6A显示了靶向DJ-1基因并包括脊髓灰质炎病毒IRES的根据本专利技术的功能性核酸分子(IRUP)的示意图。图6B显示了在分别用空对照质粒、SINEUP-DJ-1和在正向(Polio(d))和反向方向(Polio(i))上包括脊髓灰质炎IRES的IRUP转染的HEK293T/17细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种反式作用功能性核酸分子，其包含：/n-靶结合序列，其包含与待增强蛋白质翻译的真核靶mRNA序列反向互补的序列；和/n-调节序列，其包含内部核糖体进入位点(IRES)序列或内部核糖体进入位点(IRES)衍生的序列，并增强靶mRNA序列的翻译，/n其中所述调节序列位于靶结合序列的3'。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170920 IT 1020170001053721.一种反式作用功能性核酸分子，其包含：
-靶结合序列，其包含与待增强蛋白质翻译的真核靶mRNA序列反向互补的序列；和
-调节序列，其包含内部核糖体进入位点(IRES)序列或内部核糖体进入位点(IRES)衍生的序列，并增强靶mRNA序列的翻译，
其中所述调节序列位于靶结合序列的3'。


2.根据权利要求1所述的反式作用功能性核酸分子，其中所述靶结合序列由从3'至5'与靶mRNA序列的5'非翻译区(5'UTR)的1至50个核苷酸和靶mRNA序列的编码序列(CDS)的1至40个核苷酸反向互补的序列组成。


3.根据权利要求2所述的反式作用功能性核酸分子，其中所述靶结合序列由从3'至5'与靶mRNA序列的5'非翻译区(5'UTR)的10至45个核苷酸和靶mRNA序列的编码序列(CDS)的2至6个核苷酸反向互补的序列组成。


4.根据前述权利要求中任一项所述的反式作用功能性核酸分子，其中所述IRES序列或IRES衍生的序列在所述反式作用功能性核酸分子中相对于功能性核酸分子的5'至3'方向以正向方向定向。


5.根据前述权利要求中任一项所述的反式作用功能性核酸分子，其中所述IRES序列或IRES衍生的序列是与选自SEQIDNO：36至SEQIDNO：65的序列具有75％同源性的序列。


6.根据权利要求5所述的反式作用功能性核酸分子，其中所述IRES序列或IRES衍生的序列是与选自SEQIDNO：36至SEQIDNO：65的序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·古斯丁奇，S·祖切利，
申请(专利权)人：意大利技术基金会，国际高等研究院，
类型：发明
国别省市：意大利;IT