一种获取酵母中核糖体新生肽链复合物的方法技术

本发明专利技术涉及一种获取酵母中的核糖体新生肽链复合物的方法。所述方法包括以下步骤：（1）获取酵母样本并利用放线菌酮溶液进行前期处理；（2）将经过前期处理的酵母样本重悬于缓冲溶液II中并离心获得沉淀；（3）将步骤（2）中获得的沉淀重悬于酵母裂解液中并分装成第一份溶液和第二份溶液；（4）从步骤（3）中的第一份溶液中提取总RAN，从第二份溶液中提取RNC。利用根据本发明专利技术的方法，能够完整获取酵母中的核糖体新生肽链复合物，其与传统提取实验方法相比克服了提取酵母RNC提取操作复杂、浓度低、质量差、杂质多等缺陷。

【技术实现步骤摘要】
一种获取酵母中核糖体新生肽链复合物的方法
本专利技术涉及翻译组测序的
，尤其是涉及一种获取酵母中核糖体新生肽链复合物的方法。
技术介绍
巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统是近年来发展起来的较为完善的，被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统，外源蛋白在毕赤酵母中的过量表达，经常伴随着其他基因表达水平的改变，通过分析相关基因表达水平的差异，便于找到影响外源蛋白表达量的关键问题。然而，与其他细胞相比，毕赤酵母由于具有较坚固的细胞壁，尤其是处于稳定期的毕赤酵母细胞，其细胞壁更厚、通透性差，这些因素在去除细胞壁的方法中，都会对细胞内基因蛋白的表达情况造成影响。细胞壁的阻碍作用不仅增加了RNA的提取难度，而且低质量RNA直接会影响后续基因表达水平测定的准确性。翻译组学，是近年来新发现的一个机体内调控的重要学科。根据中心法则原理，DNA转录成mRNA，而mRNA再翻译成蛋白质多肽。在mRNA根据密码子信息进行翻译的过程中，结合在mRNA上的核糖体会在RNA链上进行移动，与tRNA逐渐结合形成蛋白质多肽链（新生肽链，Nascent-chain)，也就是核糖体新生肽链复合物（RibosomeNascent-chainComplex,RNC)。传统观念认为，基因进行了转录，就会进行翻译，而翻译组学在研究的过程中发现，转录并不等于翻译，仍然存在部分基因进行转录后不再进行翻译；而即使进行翻译的过程，不同基因的翻译比例也存在着差异，部分基因翻译比例高，而部分基本则较低；同时，翻译组学的研究过程中发现，RNC-mRNA的含量与样本中相应的蛋白表达速率也存在明显关系，不同的翻译速率决定了蛋白的表达量，甚至决定着新开蛋白的发生和表达，因些只有提取完整RNC，对正在翻译的RNC-mRNA含量进行测定，结合对应的转录组、蛋白质组学数据，推算其转录翻译效率以及不同的蛋白表达，对其细胞表型的确定、发现未知单比以及对蛋白质组学的研究具有重要意义。目前RNC提取大多利用蔗糖密度梯度离心法对破膜后的细胞溶液进行超速离心分离，能够提取RNC，定量核糖体全长的mRNA以及新生肽链，然而此方法仅针对动物新鲜细胞有较高提取效率。通常在提取动物新鲜细胞之前，会加入相应的翻译延伸抑制剂，可进入细胞内，对正在mRNA上进行翻译的核糖体进行固定，以保持翻译时的真实状况，进而通过系列操作提取高质量的RNC，而在毕赤酵母中，特别当生长到稳定期时，其通常具有较为坚固且通透性差的细胞壁，阻止延伸抑制剂的进行，对细胞中RNC以及mRNA的提取，造成严重阻碍作用，RNC-mRNA提取的含量少、质量低，也是对毕赤酵母进行更为深入研究的一项巨大挑战。因此，本领域中仍然需要一种能够完整获取真菌酵母（尤其是毕赤酵母）中的核糖体新生肽链复合物的方法，从而促进蛋白质转录翻译的研究及应用。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种能够完整获取毕赤酵母中核糖体新生肽链复合物的方法，其与传统提取实验方法比较克服了提取毕赤酵母RNC操作复杂、浓度低、质量差、杂质多等缺陷。上述目的通过本专利技术的以下技术方案来实现：在第一方面，提供一种获取酵母中的核糖体新生肽链复合物的方法，所述方法包括以下步骤：（1）获取酵母样本并利用放线菌酮溶液进行前期处理；（2）将经过前期处理的酵母样本重悬于缓冲溶液II中并离心获得沉淀；（3）将步骤（2）中获得的沉淀重悬于酵母裂解液中并根据实验需求分装成第一份溶液和第二份溶液；（4）从步骤（3）中的第一份溶液中提取总RAN，从第二份溶液中提取RNC。在一个优选方案中，所述检测对象为真菌酵母中的毕赤酵母。在根据第一方面所述的方法中，通过前期采用放线菌酮做为延伸抑制剂对毕赤酵母进行前处理，对样本中正在进行翻译的RNC以及mRNA起到固定作用，保持翻译过程中的即时状态；进而采用真菌裂解液对毕赤酵母细胞壁进行裂解，破碎细胞，释放其中物质，根据不同物质的沉降度不同，采用蔗糖密度离心的方法对释放物质进行梯度密度离心，收集其中完整沉淀的RNC，并采用相关检测方法对所提核糖体新生肽链复合物进行完整度检测。根据第一方面所述的方法，在步骤（1）中，所述前期处理包括将酵母样本在50-200ug/mL的放线菌酮溶液中室温孵育2-10min，然后在缓冲液I中孵育5-20min并离心获得沉淀。通过利用所述技术方案，放线菌酮能够抑制细胞内翻译延伸，保存即时翻译的表达状态，起到类似固定作用，从而使得酵母样本中的核糖体新生肽链复合物能保持完整。根据前述第一方面所述的方法，在步骤（1）中，所述缓冲溶液I为含有10-30mMpH6-8的磷酸二氢钾和5-20mM二硫苏糖醇（DTT）和50-200ug/mL放线菌酮的溶液。根据前述第一方面所述的方法，在步骤（2）中，所述缓冲溶液II为含有10-30mMpH6-8的磷酸二氢钾、1-2M山梨糖醇、0.2-1mMMgCl2、100-200U/mL酵母裂解酶、50-200ug/mL放线菌酮的溶液。根据前述第一方面所述的方法，在步骤（3）中，所述酵母裂解液为含有5-20mMpH7.4的Tris-HCL、3-10mMMgCl2、50-150mMKCl、1-3mMDTT、50-150ug/mL放线菌酮和0.5-2%TritonX-100的缓冲溶液。利用所述技术方案，采用不同的盐离子与Triton（可用作去污剂）的组合，相比现有裂解液能够对细胞壁较厚、难以裂解的真菌酵母（例如毕赤酵母，尤其是在稳定期内）的细胞壁进行有效裂解，从而获得完整的核糖体新生肽链复合物。根据前述第一方面所述的方法，在步骤（4）中，提取总RNA包括利用提取试剂来提取总RNA。在一个优选方案中，所述提取试剂为Trizol。根据前述第一方面所述的方法，在步骤（4）中，提取RNC包括如下步骤：（a）将第二份溶液在0-4℃的离心机中离心，获得上清液并转移至分离用蔗糖缓冲溶液中；（b）然后在0-4℃的超高速离心机中离心得到酵母样本中的RNC；（c）利用RNC提取试剂从步骤（b）中获得的RNC中提取NAC-RNA。在一个优选方案中，所述RNA提取试剂为Trizol。通过所述技术方案，利用蔗糖密度梯度离心，能够结合不同密度的蔗糖溶液和离心力作用，根据RNC与其他物质的沉降度不一样而起到充分的分离作用。根据前述第一方面所述的方法，在步骤（4）中，所述分离用蔗糖缓冲溶液为含有5-20mMpH7.4的Tris-HCL、3-10mMMgCl2、50-200mMKCl、1-3mMDTT、50-200ug/mL放线菌酮的缓冲溶液。根据前述第一方面所述的方法，在步骤（1）之后和步骤（2）之前还具有采用液氮或者干冰-乙醇体系对经过前期处理的酵母样本进行速冻并在低于-80℃的温度下储存和运输的步骤。在一个优选方案中，该温度优选为-80至-196℃。综上所述，本专利技术包括以下至少一种有益技术效果：1.利用根据本专利技术的方法，能够完整获取酵母（尤其是毕赤酵母）样本中的核糖体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种获取酵母中核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n（1）获取酵母样本并利用放线菌酮溶液进行前期处理；/n（2）将经过前期处理的酵母样本重悬于缓冲溶液II中并离心获得沉淀；/n（3）将步骤（2）中获得的沉淀重悬于酵母裂解液中并分装成第一份溶液和第二份溶液；/n（4）从步骤（3）中的第一份溶液中提取总RAN，从第二份溶液中提取RNC。/n

【技术特征摘要】
1.一种获取酵母中核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）获取酵母样本并利用放线菌酮溶液进行前期处理；
（2）将经过前期处理的酵母样本重悬于缓冲溶液II中并离心获得沉淀；
（3）将步骤（2）中获得的沉淀重悬于酵母裂解液中并分装成第一份溶液和第二份溶液；
（4）从步骤（3）中的第一份溶液中提取总RAN，从第二份溶液中提取RNC。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母为毕赤酵母。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述前期处理包括将酵母样本在50-200ug/mL的放线菌酮溶液中室温孵育2-10min，然后在缓冲液I中孵育5-20min并离心获得沉淀。


4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述缓冲溶液I为含有10-30mMpH6-8的磷酸二氢钾和5-20mM二硫苏糖醇（DTT）和50-200ug/mL放线菌酮的溶液。


5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述缓冲溶液II为含有10-30mMpH6-8的磷酸二氢钾、1-2M山梨糖醇、0.2-1mMMgCl2、100-200U/mL酵母裂解酶、50-200ug/mL放线菌酮的溶液。


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【专利技术属性】
技术研发人员：董鸣，何慧琼，彭龙，
申请(专利权)人：武汉承启医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42