一种用于血流感染病原诊断的血浆游离DNA标志物制造技术

本发明专利技术公开了一种用于血流感染病原诊断的血浆游离DNA标志物。本发明专利技术提供了一种血浆游离DNA的处理方法，包括如下步骤：从待测血浆游离DNA中选择大小为60‑140bp的片段，该方法可作为通过血浆游离DNA进行血流感染病原体检测的样本前处理方法。本发明专利技术对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、鲍曼不动杆菌感染的血浆样本中游离核酸分布范围进行了研究，确定了这5种细菌在血浆中的游离核酸片段分布。本发明专利技术对于提高血浆宏基因组检测中病原检测的灵敏度，指导设计PCR扩增产物片段长度范围，以提高PCR检测灵敏度具有重要意义。本发明专利技术为血浆游离DNA检测产品开发过程中的病原模拟样本制备提供依据。

【技术实现步骤摘要】
一种用于血流感染病原诊断的血浆游离DNA标志物
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于血流感染病原诊断的血浆游离DNA标志物。
技术介绍
血浆游离DNA是一种游离于细胞外的DNA。目前认为血中的游离DNA来源与凋亡、坏死和细胞主动分泌DNA有关。正常生理情况下，凋亡和坏死细胞会很快被清除掉，因此健康人血中游离DNA浓度很低。在恶性肿瘤、器官移植或感染等情况下，游离核酸释放较多，不能被机体有效清除，因此血浆中游离核酸浓度会升高。血流感染是各种病原微生物入侵血流引起的感染，包括细菌、病毒、真菌等。当发生血流感染时，病原体在血液中进行繁殖代谢或被白细胞吞噬，其细胞被破坏后会将胞内的DNA释放到血液中成为血浆游离DNA，因此血浆中会同时存在人源的游离DNA和病原体的游离DNA。对于人源游离DNA，目前已经有比较全面的研究，认为人源细胞在凋亡或坏死过程中，基因组DNA会与核小体缠绕，受核小体大小的影响，在血浆中呈现约166bp的DNA片段分布；对于病原体游离DNA，它们在血液中的释放和降解机制目前研究较少。目前，国内外有多家公司开展通过血浆游离DNA进行血流感染病原体的检测。以美国Karius公司的Kariustest为例，该方法通过宏基因组二代测序的方式对血浆中的全部游离DNA进行检测，检测后的数据与人源数据库进行比对。去除人源核酸序列，将剩余DNA序列与病原数据库对比，根据比对结果判断感染病原体类型，该方法可同时检测上千种病原体。但是，该方法在检测过程中会检测到大量的人源核酸序列，在信息分析过程中，这部分序列需要进行去除，属于“无效”序列，因此，在测序数据中会造成大量的数据浪费，并且大量的人源序列也会影响病原核酸的检测灵敏度。在实际使用中，检测性能较低并且检测成本偏高，大规模推广受限。基于PCR技术的血浆游离DNA病原体检测。该方法通过设计病原体特异性引物序列及探针，对血浆样本提取后的游离DNA进行病原体检测，该方法具有操作简单，检测周期短等优势。但该方法在检测过程中常常会由于对扩增片段产物大小无相应指导设计方案，设计盲目性较高，在实际应用中需要对大量引物进行筛选确定。
技术实现思路
本专利技术针对血流感染常见的几种病原体类型，建立了其在血浆中的游离DNA片段大小特征，可作为血流感染诊断的特异性生物标志物，并且通过该特征，可指导现有检测产品进行进一步优化，提升检测性能。第一方面，本专利技术要求保护一种血浆游离DNA的处理方法。本专利技术所要求保护的血浆游离DNA的处理方法，可包括如下步骤：从待测血浆游离DNA中选择大小为60-140bp的片段。进一步地，该方法可作为通过血浆游离DNA进行血流感染病原体检测的样本前处理方法。进一步地，该方法可作为从血浆游离DNA中去除人源游离DNA的方法。更进一步地，该方法可作为通过血浆游离DNA采用高通量测序技术进行血流感染病原体检测的样本前处理方法。第二方面，本专利技术要求保护一种通过血浆游离DNA进行血流感染病原体检测的样本前处理方法。本专利技术所要求保护的通过血浆游离DNA进行血流感染病原体检测的样本前处理方法，可包括如下步骤：(A1)从待测血浆中提取游离DNA，进行末端修复和加A，并连接接头，得到DNA文库；(A2)从所述DNA文库中选择所述游离DNA片段大小为60-140bp的片段，得到测序文库，所述测序文库即为处理后样本。所述方法为非疾病诊断治疗方法。在本专利技术的具体实施例中，步骤(A2)中从所述DNA文库中选择的片段大小约为150-230bp(接头序列约为90bp，靶标游离DNA片段大小约为60-140bp)。进一步地，利用所述方法制备得到的测序文库(处理后样本)适用于利用高通量测序技术检测血流感染病原体。第三方面，本专利技术要求保护一种提高血浆游离DNA中病原体检出率的方法。本专利技术所要求保护的提高血浆游离DNA中病原体检出率的方法(高通量测序法)，可包括如下步骤：(A1)从待测血浆中提取游离DNA，进行末端修复和加A，并连接接头，得到DNA文库。该步骤中，进行末端修复后，通过酶反应将核酸片段3’端进行补平，并且同时在3’端添加A碱基形成粘性末端。该步骤中，在连接接头后，还可包括对连接产物进行磁珠(如XP磁珠)纯化的步骤，目的是去除残留的小片段接头序列。(A2)从所述DNA文库中选择所述游离DNA片段大小为60-140bp的片段，得到测序文库。该步骤中，在进行片段选择前还包括文库扩大的步骤。具体可通过进行PCR扩增实现，目的是放大文库信号，得到大量文库序列。该步骤中，进行片段选择可通过磁珠纯化实现。在本专利技术的具体实施方式中，具体是通过如下实现的：扩大后的所述DNA文库中加入0.7倍体积的XP磁珠(吸附约230bp以上的片段)，放置于磁力架上，然后向上清(主要为小于230bp的片段)中加入1.2倍体积的XP磁珠(吸附大于150bp的片段)，此时磁珠吸附的片段主要为150-230bp之间的核酸(该核酸长度为添加测序接头后的长度，去除接头序列后，对应的插入片段大小约为60-140bp之间)。(A3)对所述测序文库进行上机测序，从测序结果中获得所述待测血浆中病原体的检测结果。该步骤中，去除测序数据中的人源序列，将剩余序列与病原体序列库进行比对，得到病原体比对结果。所述方法为非疾病诊断治疗方法。如用于检测血制品是否合格，是否含有病原体或者被病原体感染。在本专利技术的具体实施例中，步骤(A2)中从所述DNA文库中选择的片段大小约为150-230bp(接头序列约为90bp，靶标游离DNA片段大小约为60-140bp)。第四方面，本专利技术要求保护一种通过血浆游离DNA检测血流感染病原体的系统。本专利技术所要求保护的通过血浆游离DNA检测血流感染病原体的系统(适用于高通量测序法)，可包括(B1)用于从血浆中提取游离DNA的试剂和/或仪器；(B2)用于对游离DNA进行末端修复和加A，并连接接头，得到DNA文库的试剂和/或仪器；(B3)能够从所述DNA文库中选择游离DNA片段大小为60-140bp的片段作为测序文库的试剂和/或仪器；在本专利技术的具体实施例中，从所述DNA文库中选择的片段大小约为150-230bp(接头序列约为90bp，靶标游离DNA片段大小约为60-140bp)。在本专利技术的具体实施例中，所述(B3)中的试剂具体为XP磁珠。(B4)能够对所述测序文库进行上机测序，从测序结果中获得待测血浆中病原体的检测结果的装置。进一步地，所述(B4)中，所述装置中设有结论输出模块。所述结论输出模块用于按照如下输出结论：如果所述测序结果(即由目的片段组成的测序文库的测序结果，目的片段为连接有接头的靶标游离DNA片段，在本专利技术的具体实施方式中，接头序列约为90bp，靶标游离DNA片段大小约为60-140bp)中含有某种病原体的特异性序列信息，则所述待测血浆中含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血浆游离DNA的处理方法，包括如下步骤：从待测血浆游离DNA中选择大小为60-140bp的片段。/n

【技术特征摘要】
1.一种血浆游离DNA的处理方法，包括如下步骤：从待测血浆游离DNA中选择大小为60-140bp的片段。


2.一种通过血浆游离DNA进行血流感染病原体检测的样本前处理方法，包括如下步骤：
(A1)从待测血浆中提取游离DNA，进行末端修复和加A，并连接接头，得到DNA文库；
(A2)从所述DNA文库中选择所述游离DNA片段大小为60-140bp的片段，得到测序文库，所述测序文库即为处理后样本。


3.一种提高血浆游离DNA中病原体检出率的方法，包括如下步骤：
(A1)从待测血浆中提取游离DNA，进行末端修复和加A，并连接接头，得到DNA文库；
(A2)从所述DNA文库中选择所述游离DNA片段大小为60-140bp的片段，得到测序文库；
(A3)对所述测序文库进行上机测序，从测序结果中获得所述待测血浆中病原体的检测结果。


4.一种通过血浆游离DNA检测血流感染病原体的系统，包括
(B1)用于从血浆中提取游离DNA的试剂和/或仪器；
(B2)用于对游离DNA进行末端修复和加A，并连接接头，得到DNA文库的试剂和/或仪器；
(B3)能够从所述DNA文库中选择游离DNA片段大小为60-140bp的片段作为测序文库的试剂和/或仪器；
(B4)能够对所述测序文库进行上机测序，从测序结果中获得待测血浆中病原体的检测结果的装置。


5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于：所述(B4)中，所述装置中设有结论输出模块；
所述结论输出模块用于按照如下输出结论：如果所述测序结果中含有某种病原体的特异性序列信息，则所述待测...

【专利技术属性】
技术研发人员：申奥，王晓凤，吴红龙，
申请(专利权)人：深圳华大因源医药科技有限公司，华大生物科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44