长链非编码RNA的测序文库构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了长链非编码RNA的测序文库构建方法及其应用。其中，该长链非编码RNA的测序文库构建方法包括：对所述待测样本进行去除rRNA处理，以便得到去除rRNA的产物；基于所述去除rRNA的产物进行逆转录处理，以便得到单链DNA，其中，所述逆转录处理的引物具有SEQ ID NO：1所示的序列；将所述单链DNA进行第一扩增处理，以便得到双链DNA；将所述双链DNA进行片段化处理，以便得到DNA片段；以及将所述DNA片段进行第二扩增处理，所述第二扩增的产物构成所述测序文库。该方法先通过rRNA去除探针去除rRNA，再进行逆转录，避免了大量的rRNA对mRNA和lncRNA逆转录的影响，并且，利用rRNA去除探针去除rRNA，rRNA的去除率高，方法的稳定性好。

【技术实现步骤摘要】
长链非编码RNA的测序文库构建方法及其应用
本专利技术涉及生物
，特别是基因测序领域。具体地，本专利技术涉及长链非编码RNA的测序文库构建方法及其应用。更具体地，本专利技术涉及长链非编码RNA的测序文库构建方法，和对长链非编码RNA进行测序的方法。
技术介绍
全基因组范围内的转录组分析被广泛应用，早期的方法是从大量的组织样品中获取RNA进行测序。但此传统方法依赖于一次性总体分析数百万个细胞的基因表达，往往会掩盖特异组织中某些特化细胞具有生物学意义的基因表达差异。并且，在健康组织或肿瘤等病变组织中，某些细胞的数量稀少，除了单细胞方法没有任何其他的技术能够对它们进行分析。单细胞基因表达分析则克服了这些局限，可用于在全基因组范围内挖掘基因调节网络，尤其适用于存在高度异质性的干细胞及胚胎发育早期的细胞群体。与活细胞成像系统相结合，单细胞转录组分析更有助于深入理解细胞分化、细胞重编程及转分化等过程及相关的基因调节网络。将此技术应用于临床，理论上可以在生理或病理情况下连续追踪基因表达的动力学变化，从而监测疾病的进展。单细胞转录组分析的另一应用领域是发现亚细胞成分的基因表达谱，例如对在神经元的轴突或树突部分特异表达的基因的转录组进行分析，这些基因往往对细胞的生物学功能发挥着重要作用。目前常用的Smart-seq测序方法，产生的cDNA分子的链长更长并具有更高的产量，同时，覆盖度高并且有更低的技术偏差。但基于Smart-seq的真核细胞单细胞RNA-seq程序，仅限于检测具有poly(A)尾巴的mRNA(poly(A)+RNAs)。然而，有大量的非多聚腺苷酸RNA(poly(A)-RNA)在哺乳动物细胞中表达。标准的方法依赖于Oligo(dT)来启动逆转录(RT)。通过Oligo(dT)启动，可避免无信息核糖体RNA(rRNA)测序读长的优势，否则它们占哺乳动物细胞总RNA的90％。然而，这种方法不可避免地会排除其他没有poly(A)尾巴的RNA的信息。因此，基于RNA的高通量基因测序方法仍有待于进一步研究。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种长链非编码RNA的测序文库构建方法。需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列工作而完成的：专利技术人发现使用RNaseH法去除rRNA就可以解决上述技术中存在的不足。RNaseH是一种核糖核酸内切酶，它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，故能分解rRNA/rRNA杂交DNA探针中的rRNA。根据RNaseH的这个特性，专利技术人设计针对去除相应物种rRNA的杂交探针，如针对人、小鼠和大鼠rRNA(包括细胞质28S,18S,5SrRNA以及线粒体12S,5.8SrRNA)设计相应rRNA探针。然后，将rRNA去除探针和单细胞RNA进行杂交，用RNaseH消化与rRNA去除探针杂交互补的rRNA，最后再用DNaseI消化去除rRNA去除探针和单细胞中的基因组DNA。并且，专利技术人对逆转录的引物进行了优化处理，使逆转录仅针对长链非编码RNA(lncRNA)，避免了mRNA的干扰，从而构建针对lncRNA的测序文库。因而，根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种长链非编码RNA的测序文库构建方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：对所述待测样本进行去除rRNA处理，以便得到去除rRNA的产物；基于所述去除rRNA的产物进行逆转录处理，以便得到单链DNA，其中，所述逆转录处理的引物具有SEQIDNO：1所示的序列；将所述单链DNA进行第一扩增处理，以便得到双链DNA；将所述双链DNA进行片段化处理，以便得到DNA片段；以及将所述DNA片段进行第二扩增处理，所述第二扩增的产物构成所述测序文库。专利技术人惊奇的发现，该方法先通过rRNA去除探针去除rRNA，再进行逆转录，避免了大量的rRNA对mRNA和lncRNA逆转录的影响，并且，利用rRNA去除探针去除rRNA，rRNA的去除率高，方法的稳定性好，尤其适用于微量RNA样本中的rRNA去除，从而，该方法尤其适用于单细胞的文库构建。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种对长链非编码RNA进行测序的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：利用前述的方法构建测序文库；以及对所述测序文库进行测序，以便获得所述待测样本的序列信息。根据本专利技术的对待测样本进行测序的方法，其中构建测序文库先通过rRNA去除探针去除rRNA，再进行逆转录，避免了大量的rRNA对mRNA和lncRNA逆转录的影响，并且，利用rRNA去除探针去除rRNA，rRNA的去除率高，方法的稳定性好，尤其适用于微量RNA样本中的rRNA去除，从而，该测序文库尤其适用于单细胞的测序，并且测序的效率更高，特异性和灵敏性好。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了根据本专利技术一个实施例的长链非编码RNA的测序文库构建方法的流程示意图；图2显示了根据本专利技术一个实施例的对长链非编码RNA进行测序的方法的流程示意图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。长链非编码RNA的测序文库构建方法根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种长链非编码RNA的测序文库构建方法。专利技术人惊奇的发现，该方法先通过rRNA去除探针去除rRNA，再进行逆转录，避免了大量的rRNA对mRNA和lncRNA逆转录的影响，并且，利用rRNA去除探针去除rRNA，rRNA的去除率高，方法的稳定性好，尤其适用于微量RNA样本中的rRNA去除，从而，该方法尤其适用于单细胞的文库构建。参考图1，根据本专利技术的实施例，对该长链非编码RNA的测序文库构建方法进行解释说明，该方法包括：S10去除rRNA处理根据本专利技术的实施例，对待测样本进行去除rRNA处理，得到去除rRNA的产物。由此，通过rRNA去除探针去除rRNA，再进行后续的逆转录，避免了大量的rRNA对mRNA和lncRNA逆转录的影响，并且，利用rRNA去除探针去除rRNA，rRNA的去除率高，方法的稳定性好，尤其适用于微量RNA样本中的rRNA去除。根据本专利技术的实施例，该去除rRNA处理包括：将待测样本与rRNA去除探针进行杂交处理，得到杂交产物，该杂交产物为rRNA/rRNA杂交DNA探针杂交双链；利用RNaseH去除杂交产物中的rRNA；利用DNaseI去除杂交产物中的DNA，其中，该DNA即包括rRNA去除探针，还包括样本中含有的DNA，从而去除DNA对后续实验的影响。由此，通过该去除rRNA处理，快速高效去本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种长链非编码RNA的测序文库构建方法，其特征在于，包括：/n对待测样本进行去除rRNA处理，以便得到去除rRNA的产物，其中，所述去除处理是利用rRNA去除探针进行的；/n基于所述去除rRNA的产物进行逆转录处理，以便得到单链DNA，其中，所述逆转录处理的引物具有SEQ ID NO：1所示的序列；/n将所述单链DNA进行第一扩增处理，以便得到双链DNA；/n将所述双链DNA进行片段化处理，以便得到DNA片段；以及/n将所述DNA片段进行第二扩增处理，所述第二扩增的产物构成所述测序文库。/n

【技术特征摘要】
20181229 CN 201811639997X1.一种长链非编码RNA的测序文库构建方法，其特征在于，包括：
对待测样本进行去除rRNA处理，以便得到去除rRNA的产物，其中，所述去除处理是利用rRNA去除探针进行的；
基于所述去除rRNA的产物进行逆转录处理，以便得到单链DNA，其中，所述逆转录处理的引物具有SEQIDNO：1所示的序列；
将所述单链DNA进行第一扩增处理，以便得到双链DNA；
将所述双链DNA进行片段化处理，以便得到DNA片段；以及
将所述DNA片段进行第二扩增处理，所述第二扩增的产物构成所述测序文库。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述去除rRNA处理包括：
将所述待测样本与rRNA去除探针进行杂交处理，以便得到杂交产物；
利用RNaseH去除所述杂交产物中的rRNA；以及
利用DNaseI去除所述杂交产物中的DNA。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述杂交处理是利用PCR进行的，所述杂交处理的条件是95℃，2分钟；95-22℃，0.1℃/秒；22℃，5分钟。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述rRNA去除探针的长度...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘伟业，韩典霖，陈雪，李大为，玄兆伶，王海良，王娟，肖飞，
申请(专利权)人：浙江安诺优达生物科技有限公司，安诺优达基因科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33