一种纤毛虫单小核全基因组扩增方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种纤毛虫单小核全基因组扩增方法及其应用。扩增方法包括：1)获取纤毛虫单小核；2)纤毛虫单小核在Lysis Buffer中裂解；所述Lysis Buffer包括如下组分：400mM KOH、100mM DTT、10mM EDTA和200μM Exo‑Resistant Random Primer；3)纤毛虫单小核裂解终止；4)纤毛虫单小核裂解液全基因组扩增。与现有技术相比，本发明专利技术的扩增方法不仅提高了数据均一性，还实现了极微量核全基因组的扩增，从而解决了纤毛虫中的小核序列无法获取的问题；进一步配合适宜的扩增体系和裂解温度可以成功得到纤毛虫单小核全基因组序列。同时还建立了纤毛虫单小核应用于三代测序的制样方法，为单细胞测序技术在三代测序上的应用奠定了基础。

A method of genomic amplification of ciliate mononuclear and its application

【技术实现步骤摘要】
一种纤毛虫单小核全基因组扩增方法及其应用
本专利技术涉及高通量测序
，更具体地，涉及一种纤毛虫单小核全基因组扩增方法及其在三代测序技术中的应用。
技术介绍
高通量测序需要从大量细胞中获得足够的DNA样品，得到的测序结果是这些细胞“整体”的一个表征。由于细胞异质性，相同表型的细胞的遗传信息可能存在显著性差异，很多低丰度的信息会在整体表征中丢失。如实体瘤样本中提取总DNA，50％以上来源于非癌性成纤维细胞、内表皮细胞、巨噬细胞或者淋巴细胞，使得癌细胞的信号可能被隐藏。同时，自然界还存在众多不可以在实验室条件下大量培养、富集的生物，由于数目的限制，这些生物的序列信息不能够通过高通量测序获得。由于以上的局限性，单细胞测序技术应运而生。单细胞测序技术是能够在单个细胞的水平上，对生物基因组进行高通量测序分析的技术。该技术不仅能够分析表型相同细胞的遗传信息的异质性，还能获得难以培养的微生物的遗传信息。第三代测序是指单分子测序技术。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。以OxfordNanopre测序技术为例，其核心是由很多α溶血素蛋白组成纳米孔，核酸外切酶依附在孔一侧外表面，合成的环糊精作为传感器共价结合在纳米孔内表面。当DNA模板进入纳米孔时，依附的核酸外切酶会顺序剪切掉穿过纳米孔道的DNA碱基，每一个碱基通过纳米孔时都会产生一个阻断信号，根据阻断的电流变化可以检测出相应碱基的种类，得到DNA分子的序列。第三代测序技术有通量高、测序时间短、读长长、成本低、无需对核苷酸进行标记、不需要复杂的光学探测系统的优势。结合单细胞分选技术，通过全基因组扩增技术和高通量测序技术，单细胞的全基因组分析已经成为可能，并已有一些应用的实例。全基因组扩增技术可对非常微量的DNA进行扩增获得大量DNA，故被认为是目前解决这一难题的一种基本方法，已被广泛用于法医学、单基因遗传病的诊断及疾病基因的分析等领域研究，并取得了良好的效果。但同时该技术也存在一些局限性，针对单细胞真核原生动物纤毛虫，如四膜虫、小口钟虫等，它们拥有大核和小核两个细胞核，营养生长时期转录活跃的“体细胞核”为多倍体(如四膜虫为45个拷贝)的大核，DNA含量多，在营养时期表达活跃，执行转录功能；转录沉默的二倍体小核是“生殖细胞核”，DNA含量少，保存遗传信息，小核包含物种全部遗传信息，在有性生殖过程中会程序性地删除后加工形成子代大核中的DNA，因此获取纯小核基因组显得格外重要。然而现有技术对这种双核单细胞生物进行全基因组分析发现获得的基因组几乎全部都是大核信息，而传统的大小核分离方法是通过梯度离心的方式将大小核分离，分别获得的大核基因组和小核基因组，而这样获取的信息纯度均无法达到100％，尤其对于小核基因组来说，多倍体的大核的一点点污染对于小核基因组的纯度会造成很大影响。因而，现有技术分析方法无法展示纤毛虫单细胞的全貌，如何获取单细胞小核的遗传信息，并进行综合分析，全方位、多层的展示该细胞的状态，仍是行业难点。
技术实现思路
针对现有技术中无法获得单小核序列信息的技术问题，本专利技术提出了一种纤毛虫单小核全基因组扩增方法及其应用，该方法能够实现极微量核DNA的扩增，配合优化后的反应体系、扩增温度、样品纯化方法，获得的样品可以成功得到小核全基因组序列，为单细胞测序技术在三代测序上的应用奠定了基础。为实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术的第一个目的是提出一种纤毛虫单小核全基因组扩增方法，包括如下步骤：(1)获取纤毛虫单小核；(2)纤毛虫单小核在LysisBuffer中裂解；所述LysisBuffer包括如下组分：400mMKOH、100mMDTT、10mMEDTA和200μMExo-ResistantRandomPrimer；(3)纤毛虫单小核裂解终止；(4)纤毛虫单小核裂解液全基因组扩增。进一步地，所述步骤(2)纤毛虫单小核裂解温度为65℃。进一步地，步骤(2)的具体操作方法为：纤毛虫单小核放置于1.2μLPBS中，然后加入0.9μLLysisBuffer，65℃裂解细胞；步骤(3)使用0.9μL裂解终止液终止裂解；步骤(4)使用12μL扩增反应液进行全基因组扩增。更进一步地，所述裂解终止液包括以下组分：400mMHCl、600mMTris-HCl(1M，pH7.5)。进一步地，所述步骤(4)全基因组扩增反应时间为8h。本专利技术的第二个目的是提出一种纤毛虫单小核全基因组扩增试剂盒，包括LysisBuffer裂解液和扩增反应液，所述LysisBuffer裂解液包括如下组分：400mMKOH、100mMDTT、10mMEDTA和200μMExo-ResistantRandomPrimer。进一步地，所述试剂盒还包括裂解终止液，所述裂解终止液包括以下组分：400mMHCl、600mMTris-HCl(1M，pH7.5)。本专利技术的第三个目的是提出如上述任一项所述纤毛虫单小核全基因组扩增方法在制备纤毛虫三代测序样品中的应用。本专利技术的第四个目的是提出一种纤毛虫单小核三代测序样品的制备方法，包括：1)用上述任一项所述方法获得纤毛虫单小核全基因组扩增产物；2)将全基因组扩增产物用Blood&CellCultureDNAMiniKit产物纯化试剂盒进行纯化获得一次纯化产物；3)一次纯化产物用1×AgencourtAMPureXP进行纯化获得三代测序样品。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术针对无法获得小核序列信息的技术问题，开发了纤毛虫单小核全基因组扩增方法，与现有试剂盒相比，可以根据下游实验需求选择相应的体系和时间，调整扩增过程，节约成本。同时配制的裂解液不仅提高了数据均一性，还实现了极微量核全基因组的扩增，从而解决了纤毛虫中的小核序列无法获取的问题；进一步配合适宜的扩增体系和裂解温度可以成功得到小核全基因组序列。同时还建立了纤毛虫单小核应用于三代测序的制样方法，为单细胞测序技术在三代测序上的应用奠定了基础。附图说明图1为实施例1中嗜热四膜虫小核扩增产物进行PCR扩增后的凝胶图，其中图1A为现有技术扩增方法处理小核对应的凝胶图，图1B为本专利技术的扩增方法处理小核对应的凝胶图。图2为实施例2中小口钟虫原始数据初步分析质控图。图3为实施例3中不同裂解液条件下扩增产物的覆盖度曲线。图4为实施例4中不同裂解温度条件下扩增产物的覆盖度曲线。图5为实施例5中不同扩增体系条件下扩增产物的覆盖度曲线。图6为实施例6中不同扩增时间条件下扩增产物的覆盖度曲线。具体实施方式展示一下实例来具体说明本专利技术的某些实施例，且不应解释为限制本专利技术的范围。对本专利技术公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本专利技术的的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纤毛虫单小核全基因组扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)获取纤毛虫单小核；/n(2)纤毛虫单小核在Lysis Buffer中裂解；所述Lysis Buffer包括如下组分：400mMKOH、100mM DTT、10mM EDTA和200μM Exo-Resistant Random Primer；/n(3)纤毛虫单小核裂解终止；/n(4)纤毛虫单小核裂解液全基因组扩增。/n

【技术特征摘要】
1.一种纤毛虫单小核全基因组扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)获取纤毛虫单小核；
(2)纤毛虫单小核在LysisBuffer中裂解；所述LysisBuffer包括如下组分：400mMKOH、100mMDTT、10mMEDTA和200μMExo-ResistantRandomPrimer；
(3)纤毛虫单小核裂解终止；
(4)纤毛虫单小核裂解液全基因组扩增。


2.根据权利要求1所述的一种纤毛虫单小核全基因组扩增方法，其特征在于，所述步骤(2)纤毛虫单小核裂解温度为65℃。


3.根据权利要求1所述的一种纤毛虫单小核全基因组扩增方法，其特征在于，步骤(2)的具体操作方法为：纤毛虫单小核放置于1.2μLPBS中，然后加入0.9μLLysisBuffer，65℃裂解细胞；步骤(3)使用0.9μL裂解终止液终止裂解；步骤(4)使用12μL扩增反应液进行全基因组扩增。


4.根据权利要求3所述的一种纤毛虫单小核全基因组扩增方法，其特征在于，所述裂解终止液包括以下组分：400mMHCl、600mMTris-HCl(1M，pH7.5)。


5.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：缪炜，柴小翠，陈凯，熊杰，张晶，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42