一种纳米结构人工酶信号探针的多通道Fibrin检测方法技术

本发明专利技术公开了一种纳米结构人工酶信号探针的多通道Fibrin检测方法。一种新型的DNA四面体三维探针合成的人工酶，用于检测纤维蛋白，具有良好的稳定性和较强的穿透性及灵敏度,DNA作为一种多功能的生物纳米材料，在纳米结构自组装、生物免疫传感器等领域有着突出的应用，DNA四面体三维探针作为人工酶的骨架，给hemin/G4‑DNAzyme提供一个稳定的化学环境，而构建一种新型人工酶(Tetrazyme)。人工酶中仅需要浓度为0.6μM的DNA、80μM的CREKA就可以对纤维蛋白进行高效地检测。结果表面，该新型电化学检测方法能高效便捷的检测纤维蛋白且灵敏度高。

Multi channel fibrin detection method for nanostructured artificial enzyme signal probe

【技术实现步骤摘要】
一种纳米结构人工酶信号探针的多通道Fibrin检测方法
本专利技术涉及医疗检测
，尤其涉及一种纳米结构人工酶信号探针的多通道Fibrin检测方法。
技术介绍
肿瘤是威胁人们生命健康的主要疾病之一，并且恶性肿瘤的发病率逐年增加，所以肿瘤细胞的高效筛查、诊断与治疗成为了关键因素，而纤维蛋白的检测对于癌细胞的早期筛查有着重要的意义，通过研究表明，恶性肿瘤细胞间质中含有高浓度纤维网状结构的纤维蛋白，并且能够使得血管的通透性变大，血浆蛋白渗出的间质形成纤维蛋白，从而给癌细胞的生长与转移提供了良好的条件。目前检测纤维蛋白的方法主要是萤光成像、乳胶凝集、酶联免疫法。荧光成像法虽然检测灵敏度高，但由于需要使用自发荧光物质和血红蛋白的吸收从而限制了其在活体细胞中的应用。乳胶凝集法因其具有良好的稳定性和较高的灵敏度是检测纤维蛋白最常用的方法，但是由于特异性较差、操作比较繁琐从而限制了其在临床诊断中的应用。酶联免疫吸附法采用生物酶，使其具有较高的特异选择性，但是采用的生物酶存在价格昂贵、结构复杂、易变性失活且不易保存等缺点，不易于临床上对纤维蛋白进行检测。因此探求更精准、高效灵敏的检测方法仍然是个挑战。电化学免疫生物传感器能够将目标识别元件中的化学变化量转变成与检测物浓度有关的电信号，并通过检测仪进行处理与显示，以便更直观的展示检测结果。辣根过氧化物酶因其具有稳定性好、效率高、可商品化等优点，是目前电化学生物传感器最常用的放大信号酶之一，然而由于它在界面上不可控性以及无序性使得它不容易控制从而导致酶反应效率不高，因此迫切需要一种稳定性好、可控性强的人工酶。DNA四面体纳米结构在2004年首次被开发就引起了人们极大的兴趣，它是利用互补配对原则，将各链自动杂交组合而形成的具有四面体形状的DNA三维立体纳米结构，每个DNA四面体结构至少是由四条ssDNA单链构成，DNA四面体相对于单链DNA探针具有较好的稳定性及特异性。DNA四面体纳米结构与生物传感器相结合，具有响应快、使用方便、成本低等特点。而G-四链体是一段含有G碱基序列的DNA，它能够与血红素(hemin)结合，形成类似于HRP酶活性的hemin/G4-DNAzyme。本研究构建了基于DNA四面体核酸框架和G-四链体的一种新型人工酶(Tetrazyme)，将该新型人工酶与纤维蛋白的适配体-归巢肽(CREKA)化学键共价结合,用于纤维蛋白的高灵敏检测电化学生物传感器的信号放大。相比传统的检测方法，该免疫传感器检测灵敏度高，检测时间短，成本低，既可以对单一样品进行大规模的重复检测，也能够对不同的样品同时进行分组测量，为临床检验提供了一种高效便捷的方法。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种纳米结构人工酶信号探针的多通道Fibrin检测方法，引用了电化学免疫传感器中的16通道丝网印刷碳电极，先将Fibrin孵育到碳电极上面，然后再将新型的人工酶修饰到Fibrin里面进行反应，只需两步就能够对所需的蛋白进行检测，这种传感器与传统的检测方法相比制备时间大大缩减，特异靶向性和稳定性都明显提高，并且降低了实验成本，为纤维蛋白的检测提供了一个简便、高灵敏度、高选择性、廉价的检测方法。为实现上述目的，本专利技术提供了一种纳米结构人工酶信号探针的多通道Fibrin检测方法，包括以下步骤：步骤1、具有类HRP活性的新型人工酶；步骤2、以免疫电极为工作电极，碳电极为对电极，AgCl电极为参比电极，取出电极条，用Milli-Q水冲洗电极表面，再用氮气吹干残留的水珠；步骤3、在电极通道上滴入纤维蛋白37℃反应2h，用1×PBS缓冲溶液冲洗，氮气吹干，再取30μL2％的BSA溶液滴在电极表面37℃封闭30min，用1×PBS缓冲溶液冲洗，氮气吹干，再将制备好的信号探针人工酶滴加10μL到电极通道上，37℃孵育2.5h，用1×PBS缓冲溶液冲洗，氮气吹干，将底物TMB滴在吹干后的电极表面；步骤4、用电化学检测仪器以循环伏安曲线法和稳态时间-电流曲线法进行电化学表征，以检测所制作电极的灵敏度。进一步地，所述步骤1合成新型人工酶具体步骤为：步骤1、取100μM的Tetra-a-NH2、Tetra-b-G4、Tetra-c-G4、Tetra-d-G4四条单链各2μL和12μL的TMK缓冲液均匀混合，溶液放置PCR仪，95℃加热5min，迅速降温到4℃，持续30s以上，得到终浓度为10μM的DNA四面体/G4信号探针；步骤2、用Q水将归巢肽(CREKA)配制成5mg/mL的溶液，再称取3.1mg(15mM)的EDC与8.9mg(80mM)的NHS加入溶液中37℃活化处理30min，取其溶液与DNA四面体、Hemin(5mM)、TMK(10×)、Q水按比例混合，摇床箱中，37℃反应3h，摇床速度300rpm，形成具有类HRP活性的新型人工酶。进一步地，所述稳态-时间电流曲线法测量的电位为0V，检测时间为100s。进一步地，所述DNA四面体在K+的诱导条件下形成稳定的G四链体，再将血红素(Hemin)与G四链体相嵌合，形成稳定的G-quadruplex-HeminDNAzyme。进一步地，所述DNA四面体与归巢肽(CREKA)通过化学键共价结合形成具有类HRP活性的新型人工酶。进一步地，所述电化学检测仪器包括梯度PCR仪、16通道电化学生物传感系统。进一步地，所述免疫电极、碳电极、AgCl电极均为16通道丝网印刷碳电极。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种简单的电化学免疫传感器平台与一种新型的DNA四面体三维探针合成的人工酶，用于检测纤维蛋白，具有良好的稳定性和较强的穿透性及灵敏度，DNA作为一种多功能的生物纳米材料，在纳米结构自组装、生物免疫传感器等领域有着突出的应用，DNA四面体三维探针作为人工酶的骨架，给hemin/G4-DNAzyme提供一个稳定的化学环境，而构建一种新型人工酶(Tetrazyme)。人工酶中仅需要浓度为0.6μM的DNA、80μM的CREKA就可以对纤维蛋白进行高效地检测。结果表面，该新型电化学检测方法能高效便捷的检测纤维蛋白且灵敏度高。另外，传统的电极一般只能够同一个电极检测单一的样品，而本方案中的电极印有16个工作电极，既可以对单一样品进行大规模的重复检测，也能够对不同的样品同时进行多组测量；采用多通道电化学组装技术，不仅能够提高检测的灵敏度还能在电极表面对抗体抗原进行固定。以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。附图说明图1是在-0.3～0.7V电势范围内，以0.1v/s的速度进行扫描，得出的循环伏安曲线图。图2是人工酶催化电化学所形成的时间与电流的关系图。图3是DNA浓度对检测性能的优化图。图4是归巢肽CREKA浓度检测性能的优化图。图5是新型人工酶与碳电极上纤维蛋白反应时间的优化图。图6是新型人工酶合成过程的温本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳米结构人工酶信号探针的多通道Fibrin检测方法，其特征包括以下步骤：/n步骤1、合成具有类HRP活性的新型人工酶；/n步骤2以免疫电极为工作电极，碳电极为对电极，AgCl电极为参比电极，取出电极条，用Milli-Q水冲洗电极表面，再用氮气吹干残留的水珠；/n步骤3、在电极通道上滴入纤维蛋白37℃反应2h，用1×PBS缓冲溶液冲洗，氮气吹干，再取30μL2％的BSA溶液滴在电极表面37℃封闭30min，用1×PBS缓冲溶液冲洗，氮气吹干，再将制备好的信号探针人工酶取10μL滴到电极通道上，37℃孵育2.5h，用1×PBS缓冲溶液冲洗，氮气吹干，将底物TMB滴在吹干后的电极表面；/n步骤4、用电化学检测仪器以循环伏安曲线法和稳态时间-电流曲线法进行电化学表征，以检测所制作电极的灵敏度。/n

【技术特征摘要】
1.一种纳米结构人工酶信号探针的多通道Fibrin检测方法，其特征包括以下步骤：
步骤1、合成具有类HRP活性的新型人工酶；
步骤2以免疫电极为工作电极，碳电极为对电极，AgCl电极为参比电极，取出电极条，用Milli-Q水冲洗电极表面，再用氮气吹干残留的水珠；
步骤3、在电极通道上滴入纤维蛋白37℃反应2h，用1×PBS缓冲溶液冲洗，氮气吹干，再取30μL2％的BSA溶液滴在电极表面37℃封闭30min，用1×PBS缓冲溶液冲洗，氮气吹干，再将制备好的信号探针人工酶取10μL滴到电极通道上，37℃孵育2.5h，用1×PBS缓冲溶液冲洗，氮气吹干，将底物TMB滴在吹干后的电极表面；
步骤4、用电化学检测仪器以循环伏安曲线法和稳态时间-电流曲线法进行电化学表征，以检测所制作电极的灵敏度。


2.如权利要求1所述的一种纳米结构人工酶信号探针的多通道Fibrin检测方法，所述步骤1合成新型人工酶具体步骤为：
步骤1、取100μM的Tetra-a-NH2、Tetra-b-G4、Tetra-c-G4、Tetra-d-G4四条单链各2μL和12μL的TMK缓冲液均匀混合，溶液放置PCR仪，95℃加热5min，迅速降温到4℃，持续30s以上，得到终浓度为10μM的DNA四面体/G4信号探针；
步骤2、用Q水将归巢肽(CREKA)配制成5mg/mL的溶液，再称取3.1mg(15...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾冬冬，王彬，徐晓慧，李晖，潘洪志，
申请(专利权)人：上海健康医学院，
类型：发明
国别省市：上海;31