一种蛋白酶筛选底物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种蛋白酶筛选底物及其制备方法和应用，属于检测技术领域。本发明专利技术提供了一种测定蛋白酶酶活的方法，利用此方法检测蛋白酶的酶活时，仅需将待测样品与蛋白酶筛选底物混合后观察混合液的颜色变化和颜色变化的响应时间即可，操作简单。本发明专利技术提供了一种测定蛋白酶酶活的方法，此方法以大米蛋白为底物，因此，利用此方法可准确的测定出蛋白酶对大米蛋白的酶活，在筛选得到更多对大米蛋白酶活高的蛋白酶方面具有极高的应用前景。

A protease screening substrate and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白酶筛选底物及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种蛋白酶筛选底物及其制备方法和应用，属于检测

技术介绍
大米是我国第一大粮食品种。大米蛋白则是国际公认的优质蛋白。与大豆蛋白、乳清蛋白等蛋白相比，大米蛋白的营养抑制因子含量少，无过敏反应，大米蛋白包含人体所需氨基酸且氨基酸配比合理，另外，大米蛋白的生物价远超大豆蛋白，可与虾及牛肉等的生物价相媲美，符合世界卫生组织(WHO)推荐的理想模式。但是，由于大米蛋白中含有较多谷蛋白，不易溶解，因此，大米蛋白多用作动物饲料添加剂。为了提高大米蛋白的附加值，通常将其水解成短肽或氨基酸后制成营养价值更高的短肽或氨基酸营养液，作为高价值添加剂运用于保健品、饮料、化妆品等行业。高纯度的大米肽价格在10万/吨以上。目前，主要是使用酶解法对大米蛋白进行水解。但是，现有的酶解法仍具有许多缺陷，其中，酶解法所使用的蛋白酶对大米蛋白的酶活不高所导致的水解大米蛋白效率低、水解大米蛋白所得水解液中多肽含量低是最严重的缺陷之一。例如，公开号为CN1102229643A的专利申请文本中，专利技术人使用碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶三种酶复配水解大米蛋白，水解3h，仅可使反应液中多肽的含量达50％左右；公开号为CN106967773A的专利申请文本中，专利技术人使用亮氨酸氨肽酶水解大米蛋白，水解4h，仅可使反应液中多肽的含量达30％～40％。因此，筛选得到更多对大米蛋白酶活高的蛋白酶至关重要。福林酚法(中华人民共和国专业标准GB/T23527-2009：蛋白酶制剂)是目前测定蛋白酶酶活最常用的方法，利用此方法，可分别以酪蛋白、大米蛋白等多种蛋白为底物测定蛋白酶对不同蛋白的酶活。但是，福林酚法具有操作繁琐、耗时耗力等缺陷，这大大降低了蛋白酶酶活的检测效率。因此，急需找到一种操作简单的测定蛋白酶酶活的方法，尤其是以大米蛋白为底物测定蛋白酶酶活的方法。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是提供一种操作简单的测定蛋白酶酶活的方法，尤其是以大米蛋白为底物测定蛋白酶酶活的方法。[技术方案]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种制备蛋白酶筛选底物的方法，所述方法为将含有蛋白和金纳米颗粒的缓冲液进行第一次反应，得到反应液A；在反应液A中添加巯基已醇进行第二次反应，得到反应液B；将反应液B进行分离，得到蛋白酶筛选底物。在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液中，蛋白的浓度为5～100mg/mL。在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液中，蛋白的浓度为40mg/mL。在本专利技术的一种实施方式中，所述蛋白为大米蛋白。在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液中，金纳米颗粒的浓度为0.1～1.0mmol/mL。在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液中，金纳米颗粒的浓度为0.1mmol/mL。在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、Tris-EDTA缓冲液或Tris缓冲液。在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液的浓度为5～20mmol/L、pH为7～8。在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液的浓度为10mmol/L、pH为7.0。在本专利技术的一种实施方式中，所述反应液A中，巯基已醇的浓度为0.1～0.5mmol/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述反应液A中，巯基已醇的浓度为0.1mmol/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述第一次反应的温度为30～35℃、转速为180～250rpm、时间为1～4h。在本专利技术的一种实施方式中，所述第一次反应的温度为35℃、转速为180rpm、时间为1h。在本专利技术的一种实施方式中，所述第二次反应的温度为30～35℃、转速为180～250rpm、时间为20～23h。在本专利技术的一种实施方式中，所述第二次反应的温度为35℃、转速为180rpm、时间为23h。本专利技术还提供了利用上述方法制备得到的蛋白酶筛选底物。本专利技术还提供了一种测定蛋白酶酶活的方法，所述方法为将待测样品与上述蛋白酶筛选底物混合，若混合液颜色不发生变化，则待测样品的蛋白酶酶活为0或低于检出限；若混合液由酒红色变为橘色，根据公式Y＝-0.1527X+31.82计算待测样品的蛋白酶酶活；所述公式中，Y为颜色变化的响应时间，单位为s，X为酶活，单位为U/mL。本专利技术还提供了上述制备蛋白酶筛选底物的方法或上述蛋白酶筛选底物或上述测定蛋白酶酶活的方法在测定蛋白酶活性或筛选不同酶活的蛋白酶中的应用。[有益效果](1)本专利技术提供了一种测定蛋白酶酶活的方法，利用此方法检测蛋白酶的酶活时，仅需将待测样品与蛋白酶筛选底物混合后观察混合液的颜色变化和颜色变化的响应时间即可，操作简单。(2)本专利技术提供了一种测定蛋白酶酶活的方法，此方法以大米蛋白为底物，因此，利用此方法可准确的测定出蛋白酶对大米蛋白的酶活，在筛选得到更多对大米蛋白酶活高的蛋白酶方面具有极高的应用前景。附图说明图1：金纳米颗粒的全波长扫描结果。图2：金纳米颗粒的透射电镜观察结果。图3：酶解前后含有蛋白酶筛选底物溶液A1的混合液的颜色变化以及全波长扫描结果。图4：酶解前后含有蛋白酶筛选底物溶液A2的混合液的颜色变化以及全波长扫描结果。图5：酶活与颜色变化的响应时间的拟合方程。具体实施方式下述实施例中涉及的百里香粉末购自西安瑞盈生物科技有限公司；下述实施例中涉及的氯金酸粉末、巯基已醇溶液(1M)和蛋白酶购自Sigma公司；下述实施例中涉及的70％(v/v)乙醇溶液购自国药集团化学试剂有限公司；下述实施例中涉及的大米蛋白购自无锡金农生物公司。下述实施例中涉及的检测方法如下：透射电镜分析：将金纳米颗粒用蒸馏水制备成1mg/mL的金纳米溶液，并超声分散30min；取1滴超声分散后的金纳米溶液作为样品滴于碳网上，用滤纸吸干载网上的样品液滴，待样品即干时，用2％(w/v，g/100mL)磷钨酸水溶液负染，用滤纸吸干余液，晾干，在200kV加速电压下进行测试。全波长扫描分析：将金纳米颗粒用蒸馏水制备成1mg/mL的金纳米溶液，并超声分散30min；取2mL超声分散后的金纳米溶液作为样品装于比色皿中，在波长200～800nm范围内进行全波长扫描。将蛋白酶筛选底物溶液A1或含有蛋白酶筛选底物溶液A1的混合液超声分散30min；取2mL超声分散后的蛋白酶筛选底物溶液A1作为样品装于比色皿中，在波长200～800nm范围内进行全波长扫描。将蛋白酶筛选底物溶液A2或含有蛋白酶筛选底物溶液A2的混合液超声分散30min；取2mL超声分散后的蛋白酶筛选底物溶液A2作为样品装于比色皿中，在波长200～800nm范围内进行全波长扫描。下述实施例中涉及的制备方法如下：金纳米颗粒的制备方法如下(金纳米颗粒也可直接购买获得)：具体步骤如下：(1)将50g百里香粉末用500mL70本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备蛋白酶筛选底物的方法，其特征在于，所述方法为将含有蛋白和金纳米颗粒的缓冲液进行第一次反应，得到反应液A；在反应液A中添加巯基已醇进行第二次反应，得到反应液B；将反应液B进行分离，得到蛋白酶筛选底物。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备蛋白酶筛选底物的方法，其特征在于，所述方法为将含有蛋白和金纳米颗粒的缓冲液进行第一次反应，得到反应液A；在反应液A中添加巯基已醇进行第二次反应，得到反应液B；将反应液B进行分离，得到蛋白酶筛选底物。


2.如权利要求1所述的一种制备蛋白酶筛选底物的方法，其特征在于，所述缓冲液中，蛋白的浓度为5～100mg/mL。


3.如权利要求1或2所述的一种制备蛋白酶筛选底物的方法，其特征在于，所述缓冲液中，金纳米颗粒的浓度为0.1～1.0mmol/mL。


4.如权利要求1-3任一所述的一种制备蛋白酶筛选底物的方法，其特征在于，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、Tris-EDTA缓冲液或Tris缓冲液。


5.如权利要求1-4任一所述的一种制备蛋白酶筛选底物的方法，其特征在于，所述缓冲液的浓度为5～20mmol/L、pH为7～8。


6.如权利要求1-5任一所述的一种制备蛋白酶筛选底物的方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，颜正飞，秦琴，唐诚业，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32