一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术及生化检测技术领域，尤其涉及一种酶法定量检测κ‑卡拉胶的方法。利用κ‑卡拉胶酶特异性的将κ‑卡拉胶水解为还原糖，将酶灭活后，加入对羟基苯甲酰肼溶液进行显色反应，离心后测定上清液在400‑420nm处的吸光值，对比标准曲线得到κ‑卡拉胶含量。本发明专利技术检测方法线性范围好，准确度高，可在市场中推广使用。

A method of enzyme quantitative detection of kappa carrageenan

【技术实现步骤摘要】
一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法
本专利技术涉及生物技术及生化检测
，尤其涉及一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法。
技术介绍
卡拉胶(carrageenan)又称为鹿角菜胶或角叉菜胶，是从角叉菜、麒麟菜、杉藻等红藻的细胞壁中提取的天然阴离子硫酸线性多糖，根据结构中半乳糖上硫酸基的数量与连接位置以及3，6-脱水半乳糖的含量的不同，卡拉胶具有多种类型。κ-卡拉胶是三种常见卡拉胶类型(κ-、ι-和λ-卡拉胶)之一，它由交替的硫酸化-α-D-3,6-脱水半乳糖和硫酸化-β-D-半乳糖残基组成，因来源广泛，功能多样而被应用于食品、药品、化妆品等多项工业生产中，发挥凝固剂、粘合剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、增稠剂等作用。κ-卡拉胶的定量检测是κ-卡拉胶质量控制、功能研究、产品开发中的基础环节。目前，常用的κ-卡拉胶定量检测方法是苯酚-硫酸法和液相色谱-串联质谱法等。苯酚-硫酸法灵敏度高，且不需贵重仪器，但易受样品中其他多糖的干扰，且耗费时间，样品和试剂消耗较多。液相色谱-串联质谱法通过对样品进行水解、衍生及预处理，通过测定κ-卡拉胶组成单糖的含量合计得到κ-卡拉胶含量，该方法灵敏度高、准确性好，但仪器成本高、操作繁琐。对羟基苯甲酰肼(pHBH)是一种芳香族酰肼类化合物，在强碱性条件下能与β-二酮类化合物生成黄色产物。有研究表明，pHBH在高温及碱性条件下，可与葡萄糖等还原糖反应产生相似的黄色物质，反应后颜色深浅与还原糖浓度成正比，且该反应的灵敏度较高。这就为酶法定量检测κ-卡拉胶提供了可行性。综上所述，找到一种灵敏度高、准确性好、操作简便的κ-卡拉胶定量检测方法具有重大的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是常用的κ-卡拉胶定量检测方法是苯酚-硫酸法和液相色谱-串联质谱法，这两种方法分别具有重现性差和操作繁琐、费时费力的问题。为解决上述问题，本专利技术提供一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，利用特异性的κ-卡拉胶酶，将κ-卡拉胶特异性的降解为还原糖，利用对羟基苯甲酰肼(pHBH)的显色反应，通过测定400-420nm处的吸光值，测定κ-卡拉胶的含量。为达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，利用κ-卡拉胶酶特异性的将κ-卡拉胶降解为κ-卡拉胶四糖及少量二糖。将酶灭活后，加入对羟基苯甲酰肼溶液进行显色反应，离心后测定上清液在400-420nm处的吸光值，对比标准曲线得到κ-卡拉胶含量。进一步的，所述κ-卡拉胶酶为κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa，其氨基酸序列为SEQIDNO.1。SEQIDNO.1：TSQNLRPLNAKPGENWTIKWNRSDDFNQSRPNNAVDYGKWQRNPGQVQTWTWDNDNNAKEVNGVLNLTARFDDAGADRNIFQNCGGATNDLFYTSAMLKSYSKGVYGYYEAKIKGANLFPGVAPAFWMYSDIDDSLTQEGAIRYSEVDVVEMTQRGNRVSGNEMIMDHNLHAIVTTRNKVTSNGYTFQLDTNGNKIPLTNNEITTNKGRRWFRPGNPEVSHDQENVTGQASDPNRFDPRAAFHTYGCRIDQNWITWYVDNREIGRKANTKWHRPMNVALSLGIRAPYTTFCNNAFALPTRQFALNNQNKFPQTMQVDYIRVWELDGNNTNNNPPTEPIDPPSNNNLPSSGSTINLKASNNNKFITVVSNNSNTLKTTANSGTGNNQKFTITNTSDGFVSLKSSANNKFVTATSITNSPLRVGASKAFNRQKFRIETSNGKIVLKAKINNKYIVANNNVLEANGNNKNAALKFDITNFSSTANLIKKEETLEISNLK进一步的，该酶的最适反应温度为25℃，常温下即可达到该酶的最大活力，其最适反应pH值为8.0，且在pH6.0-10.0的pH值范围内基本保持稳定该酶具有良好的贮存稳定性，在4℃下可至少稳定贮存3个月。该酶具有良好的反应特异性，对于κ-卡拉胶具有高活力，但对于其他海洋多糖，如琼胶、褐藻胶、ι-卡拉胶等均无降解作用。综上，κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa具有良好的应用潜力，特别是应用于检测κ-卡拉胶含量，具有操作简便、准确度高、稳定性好的特点，且常温下即可反应，从而避免底物在高温下发生改变((ι-和λ-卡拉胶、褐藻胶、琼胶等在高温下会发生降解，产生还原糖，这些降解产物也会与pHBH发生显色反应，导致实际检测结果偏高)，从而影响定量准确性。该酶与其他已知酶的序列相似度最高为40％(最相近序列为Pseudoalteromonassp.LL1所产的kappase_P.LL1)。利用MEGA6将Cgk1_Wa与已被注释为GH16家族的κ-卡拉胶酶序列构建系统发育树，结果如图2所示：可以看出κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa处于GH16家族κ-卡拉胶酶的系统发育树中。因此，Cgk1_Wa是κ-卡拉胶酶GH16家族的一个新成员。将κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa氨基酸序列进行Blast分析并利用ClustalX2将Cgk1_Wa与GH16家族已知的7条κ-卡拉胶酶序列进行多序列比对，结果如图3所示：这7个κ-卡拉胶酶分别是来源于Pseudoalteromonascarrageenovora的CgkA_P.c(GenbankCAA50624.1)、来源于Pseudoalteromonassp.QY203的CgkX_P.QY203(GenbankAFV39914.1)、来源Pseudoalteromonastetraodonis的Cgk-K142a_P.t(GenbankBAJ61957.1)、来源于Pseudoalteromonassp.LL1的kappase_P.LL1(GenbankADD92366.1)、来源于Shewanellasp.Kz7的CgkS_S.Kz7(GenbankAHN05534.1)、来源于Zobelliagalactanivorans的CgkA_Z.g(GenbankCAZ94309.1)与来源于Zobelliasp.M-2的CgkZ_Z.M-2(GenbankAGS43006.1)。由图3可知，Cgk1_Wa除在关键催化位点严格保守外，在其他位点均显示不同程度的特异性，且Blast证实Cgk1_Wa与Pseudoalteromonassp.LL1所产的kappase_P.LL1序列相比，仅具有40％的最高相似度，表明Cgk1_Wa是GH16家族中一种新颖的κ-卡拉胶酶。上述κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa对于κ-卡拉胶具有高活力，但对于其他海洋多糖，如琼胶、褐藻胶、ι-卡拉胶等均无降解作用。其最适反应温度为25℃，在4℃下可至少稳定贮存30天，其最适反应pH值为8.0，且在pH6.0-10.0的pH值范围内基本保持稳定，酶动力学常数Km为0.07mg/mL，Kcat为27.54s-1，Km/Kcat为165.63μM-1s-1。以上可知，相较于其他κ-卡拉胶酶，本专利技术的κ-卡本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于：利用κ-卡拉胶酶特异性的将κ-卡拉胶降解为还原糖，将酶灭活后，加入对羟基苯甲酰肼溶液进行显色反应，离心后测定上清液在400-420nm处的吸光值，对比标准曲线得到κ-卡拉胶含量。/n

【技术特征摘要】
1.一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于：利用κ-卡拉胶酶特异性的将κ-卡拉胶降解为还原糖，将酶灭活后，加入对羟基苯甲酰肼溶液进行显色反应，离心后测定上清液在400-420nm处的吸光值，对比标准曲线得到κ-卡拉胶含量。


2.如权利要求1所述的酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于：所述κ-卡拉胶酶为κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa，其氨基酸序列为SEQIDNO.1。


3.如权利要求2所述的酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于：所述κ-卡拉胶酶的最适反应温度为25℃，最适反应pH值为8.0，且在pH6.0-10.0的pH值范围内基本保持稳定该酶具有良好的贮存稳定性，在4℃下可至少稳定贮存3个月；酶动力学常数Km为0.07mg/mL，Kcat为27.54s-1，Km/Kcat为165.63μM-1s-1。


4.如权利要求2所述的酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于：编码上述κ-卡拉胶酶的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.2或可翻译出SEQIDNO.1的所有基因。


5.如权利要求1或2所述的酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)κ-卡拉胶溶液的配制：称取化学级或以上纯度的κ-卡拉胶溶于缓冲液，制备具有浓度梯度的κ-卡拉胶标准溶液；
(2)pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于HCl中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：常耀光，申晶晶，薛长湖，陈广宁，张玉莹，李嘉靖，薛勇，唐庆娟，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37