一种基因测序文库的构建方法技术

提供了一种基因测序文库的构建方法，具体涉及基因测序领域，本发明专利技术的方法包括将磁性粒子与转座酶包埋复合物结合形成复合体，并用该复合体与待测序的靶DNA样品孵育，产生两端带有接头的DNA文库。

【技术实现步骤摘要】
一种基因测序文库的构建方法
本专利技术涉及测序
，尤其涉及一种基因测序文库的构建方法。
技术介绍
二代测序技术(NextGenerationSequence，NGS)以高通量、低成本的优势，自出现之日起就倍受欢迎。随着技术的发展，新一代测序技术在许多科学研究和临床检测方面都有应用。目前很多科学研究与临床应用需要快速对目标的全基因组进行测序，或者对感兴趣的目标区域进行深度测序；利用RNA-seq发现新的转录组水平上的变异，或者精确定量mRNA的表达量；分析表观遗传学因素，例如DNA的各种甲基化、DNA与蛋白之间的相互作用；对癌症进行准确测序，寻找变异位点，以便用于精准医疗，个体化治疗癌症。测序技术方面，Illumina公司研发的Miseq、Nextseq和Hiseq等测序仪，采用边合成边测序(SequencingbySynthesis,SBS)技术，支持大规模平行测序，以高通量、低成本、周期短的优势得到了广泛的欢迎。在实际利用测序的完成过程中，很多时候对时效性要求相当高，需要在基因检测的每一个环节都尽可能缩短时间。基于转座酶打断的测序文库构建技术，能够同时实现DNA片段化和接头的添加，此类方法己经有报道，比如中国专利CN105525357B公开了一种利用转座酶包埋复合体进行文库构建的方法，能够极大的减少样品处理的时间。但是，由于通过转座酶实现的DNA片段化与靶DNA的起始量有关，更多的靶DNA起始量会造成转座酶在实现DNA片段化后得到的文库片段更大，不能满足后续测序对于文库片段大小范围的要求；同时，不同起始量的靶DNA进行基于转座酶的文库构建后会得到不同量的DNA文库。因此，目前基于转座酶打断的文库构建，需要一定量的样本进行，并且对最终得到的文库进行精确定量，以便下游进行测序。常规的均一化方法，通过吸光值高低估算含有DNA量的高低，从而来吸取等量或等比例的样本，实现均一化的目的，然而通过吸光值或荧光定量的方法，会受其他同样吸收特定光谱如蛋白、其他类型核酸或质的影响，而荧光定量存在成本高，操作繁琐费时的缺陷；现有的均一化过程可以定义成定量-计算-吸取三个步骤。定量96个样本的操作时间由于各种仪器平台的不同，由几分钟到3个小时不等；计算环节，录入各样本的浓度并计算具体的吸取样本量，需要耗时约1个小时；调整移液器，从每个样本中独立吸取相应计算量的样本，实现样本之间均一化后进行下游文库构建流程，此过程需要1个小时。因此按照现有的技术流程，整个均一化的过程需要5个小时时间。在进行大批量样本文库构建时，该步骤耗时长且繁琐，虽然现在有自动化仪器的辅助，但随之的成本也将进一步提高。
技术实现思路
本专利技术提供一种构建基因测序文库的方法，所述方法包括：(1)将磁性粒子与转座酶包埋复合物接触，使使得磁性粒子与转座酶包埋复合物形成复合体；其中，每个转座酶包埋复合物包含转座酶，还包含第一接头序列和/或第二接头序列；所述第一接头序列包含第一测序接头序列和转座酶识别序列，所述第二接头序列包含第二测序接头序列和转座酶识别序列；其中，复合体中的磁性粒子与转座酶之间通过镍离子(Ni2+)-组氨酸相互作用结合；(2)将(1)中的复合体与靶DNA样品孵育，产生两端带有接头的DNA文库。根据本专利技术提供的一种基因测序文库的构建方法，所述方法包括：(1)磁性粒子与转座酶包埋复合物以一定比例结合形成复合体；(2)将(1)中的复合体与靶基因孵育；(3)将复合体从(2)中的反应体系中分离出来；(4)将(3)中的复合体和带有标签序列的接头序列的引物PCR扩增及纯化；其中，所述复合体包括磁性粒子和转座酶包埋复合物；所述转座酶包埋复合物包括转座酶、转座酶识别序列、第一测序接头序列和/或第二测序接头序列；所述PCR引物包括含有第一测序标签序列的前引物和含有第二测序标签序列的后引物。在一些实施方案中，该方法不包括对靶DNA样品中所含的靶DNA定量的步骤。在一些实施方案中，，所述磁性粒子为螯合二价金属阳离子的磁珠；作为本专利技术的优选实施方案，所述磁性粒子通过偶联匹配位的氮川三乙酸(NAT)螯合二价金属阳离子；更优选地，所述二价金属阳离子为二价镍离子(Ni2+)。在一些实施方案中，所述转座酶包埋复合物在与磁性粒子接触之前是未经纯化的。在一些实施方案中，，所述转座酶为带有蛋白纯化标签的转座酶；作为本专利技术的优选实施方案，所述蛋白标签为多聚组氨酸标签(His-tag)；优选地，所述转座酶为Tn5转座酶。在一些实施方案中，所述方法还包括(3)在孵育之后从(2)的反应体系分离复合体；和(4)以复合体作为模板进行PCR扩增。在一些实施方案中，所述PCR使用包含第一测序标签序列的前引物和包含第二测序标签序列的后引物在一些实施方案中，转座酶包埋复合物通过转座酶与磁性粒子以60U：0.5mg～2100U：0.5mg的比例相结合；作为本专利技术的优选实施方案，所述比例为750U：0.5mg。在一些实施方案中，磁性粒子与靶DNA样品在低咪唑浓度下室温振荡孵育；作为本专利技术的优选实施方案，所述低咪唑浓度为15Mm-50Mm；优选15Mm。在一些实施方案中，复合体与靶DNA样品的孵育条件为振荡速度700-2000rpm；优选1100rpm；震荡时间为20-40min；优选30min。本专利技术所用的靶DNA可以是质粒、基因组DNA或扩增的DNA等；其中，基因组DNA的样品来源可以是细胞、组织或微量DNA样品等。作为本专利技术的优选实施方案，所述接头序列及PCR引物选自IlluminaNextera测序方案的测序接头序列。作为本专利技术的优选实施方案，所述标签序列为固定的6～12个碱基的序列；作为本专利技术的优选实施方案，所述标签序列为8个碱基的固定序列。作为本专利技术的优选实施方案，所述转座酶识别序列为转座酶Tn5识别的19bp的嵌合端转座子末端。本专利技术的方法可用于新一代高通量Illumina测序平台的样本处理。其中，新一代高通量Illumina测序平台包括并不限于Miseq、Hiseq、Nextseq测序平台。作为本专利技术的优选实施方案，第一接头序列与转座酶识别序列互补序列退火形成第一接头，第二接头序列与转座酶识别序列互补序列退火形成第二接头，所述转座酶识别序列互补序列具有转座酶识别序列-反向(ME-R，即转座酶识别序列互补序列)所示的碱基序列；所述第一接头序列具有Adapter-A所示的碱基序列；所述第二接头序列具有Adapter-B所示的碱基序列。其中，ME-R为5’-phos-CTGTCTCTTATACACATCT-3’(SEQIDNO:1)；其中，phos为5’端磷酸化修饰标志。其中，Adapter-A为5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQIDNO:2)；其中，下划线部分为转座酶识别序列。其中，Adapter-B为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建基因测序文库的方法，所述方法包括：/n(1)将磁性粒子与转座酶包埋复合物接触，使得磁性粒子与转座酶包埋复合物形成复合体；/n其中，每个转座酶包埋复合物包含(a)转座酶及(b)第一接头序列和/或第二接头序列；所述第一接头序列包含第一测序接头序列和转座酶识别序列，所述第二接头序列包含第二测序接头序列和转座酶识别序列；/n其中，复合体中的磁性粒子与转座酶之间通过镍离子(Ni

【技术特征摘要】
1.一种构建基因测序文库的方法，所述方法包括：
(1)将磁性粒子与转座酶包埋复合物接触，使得磁性粒子与转座酶包埋复合物形成复合体；
其中，每个转座酶包埋复合物包含(a)转座酶及(b)第一接头序列和/或第二接头序列；所述第一接头序列包含第一测序接头序列和转座酶识别序列，所述第二接头序列包含第二测序接头序列和转座酶识别序列；
其中，复合体中的磁性粒子与转座酶之间通过镍离子(Ni2+)-组氨酸相互作用结合；
(2)将(1)中得到的复合体与靶DNA样品孵育，产生两端带有接头的DNA文库。


2.根据权利要求1所述的方法，其中该方法不包括对靶DNA样品中所含的靶DNA定量的步骤。


3.根据权利要求1或2所述的方法，所述磁性粒子为螯合二价镍离子(Ni2+)的磁珠，优选地，磁性粒子通过偶联匹配位的氮川三乙酸(NAT)螯合二价镍离子。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述转座酶包埋复合物在与磁性粒子接触之前是未经纯化的。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述转座酶带有多聚组氨酸标签；优选地，所述转座酶为Tn5转座酶。


6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊隆，夏俊秋，刘家栋，蒋浩君，吴政宪，
申请(专利权)人：江苏金斯瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32