【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞分子的原位组合标记相关申请的交叉引用本申请要求2017年9月22日提交的第62/561,806号美国临时申请的权益，其全部内容通过引用在此并入。
本专利技术总体上涉及独特地标记或条形编码细胞核、多个细胞核、细胞、多个细胞和/或组织内的分子的方法。本专利技术还涉及用于独特地标记细胞核、多个细胞核、细胞、多个细胞和/或组织内的分子的试剂盒。特别地，所述方法和试剂盒可以涉及RNA和/或cDNA的标记。背景新一代测序(NGS)可以用于识别和/或定量来自细胞样品的单一转录物。然而，这样的技术可能太复杂而无法在大样本中的单一细胞上进行。在这样的方法中，通常从裂解的细胞(即已破碎的细胞)纯化RNA转录物，然后使用逆转录将RNA转录物转化为互补DNA(cDNA)。然后可以使用NGS对cDNA序列测序。在这样的过程中，所有cDNA序列在测序前混合在一起，使得测量整个样品的RNA表达，并且单一序列不能回溯到单一细胞。用于独特地标记或条形编码来自单一细胞的转录物的方法可以涉及将单一细胞手动分离到单独的反应容器中，并且可能需要专门的设备。一种供选择的对细胞中单一转录物测序的方法是使用显微术识别单一荧光碱基。然而，该技术可能难以实施，并且限于对少量细胞测序。附图简述结合附图，根据以下描述和所附权利要求，本文公开的实施方案将变得更加充分地显而易见。图1描绘了连接核酸标签以形成标记或条形码。图2是通过原位逆转录形成cDNA的示意图。图A描绘了固定和透化的细胞。图B描绘了聚(T)引物的...
【技术保护点】
1.一种独特地标记多个细胞内的RNA分子的方法，所述方法包括：/n(a)在步骤(b)之前固定和透化第一多个细胞，其中在约8℃以下固定和透化所述第一多个细胞；/n(b)逆转录所述第一多个细胞内的RNA分子以在所述第一多个细胞内形成互补DNA(cDNA)分子，其中逆转录所述RNA分子包括将引物偶联到所述RNA分子，其中所述引物包含聚(T)序列或随机序列中的至少一种；/n(c)将所述包含cDNA分子的第一多个细胞分成至少两个初级等分试样，所述至少两个初级等分试样包括第一初级等分试样和第二初级等分试样；/n(d)向所述至少两个初级等分试样提供初级核酸标签，其中向所述第一初级等分试样提供的初级核酸标签不同于向所述第二初级等分试样提供的初级核酸标签；/n(e)将所述至少两个初级等分试样中的每一个内的cDNA分子与所提供的初级核酸标签偶联；/n(f)合并所述至少两个初级等分试样；/n(g)将所述合并的初级等分试样分成至少两个次级等分试样，所述至少两个次级等分试样包括第一次级等分试样和第二次级等分试样；/n(h)向所述至少两个次级等分试样提供次级核酸标签，其中向所述第一次级等分试样提供的次级核酸标签不...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170922 US 62/561,8061.一种独特地标记多个细胞内的RNA分子的方法，所述方法包括：
(a)在步骤(b)之前固定和透化第一多个细胞，其中在约8℃以下固定和透化所述第一多个细胞；
(b)逆转录所述第一多个细胞内的RNA分子以在所述第一多个细胞内形成互补DNA(cDNA)分子，其中逆转录所述RNA分子包括将引物偶联到所述RNA分子，其中所述引物包含聚(T)序列或随机序列中的至少一种；
(c)将所述包含cDNA分子的第一多个细胞分成至少两个初级等分试样，所述至少两个初级等分试样包括第一初级等分试样和第二初级等分试样；
(d)向所述至少两个初级等分试样提供初级核酸标签，其中向所述第一初级等分试样提供的初级核酸标签不同于向所述第二初级等分试样提供的初级核酸标签；
(e)将所述至少两个初级等分试样中的每一个内的cDNA分子与所提供的初级核酸标签偶联；
(f)合并所述至少两个初级等分试样；
(g)将所述合并的初级等分试样分成至少两个次级等分试样，所述至少两个次级等分试样包括第一次级等分试样和第二次级等分试样；
(h)向所述至少两个次级等分试样提供次级核酸标签，其中向所述第一次级等分试样提供的次级核酸标签不同于向所述第二次级等分试样提供的次级核酸标签；
(i)将所述至少两个次级等分试样中的每一个内的cDNA分子与所提供的次级核酸标签偶联；
(j)用随后的等分试样重复步骤(f)、(g)、(h)和(i)，其中最后的核酸标签包含捕获剂；
(k)合并最后的等分试样；
(l)裂解所述第一多个细胞以从所述第一多个细胞内释放cDNA分子，以形成裂解物；和
(m)向所述裂解物添加蛋白酶抑制剂和结合剂，以使所述cDNA分子结合结合剂。
2.权利要求1所述的方法，其还包括将所述合并的最后的等分试样分成至少两个最后的等分试样，所述至少两个最后的等分试样包括第一最后的等分试样和第二最后的等分试样。
3.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在约7℃以下、在约6℃以下、在约5℃以下、在约4℃以下、在约3℃以下、在约2℃以下或在约1℃以下固定和透化所述第一多个细胞。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂包括苯甲基磺酰氟(PMSF)或4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述捕获剂包括生物素，并且其中所述结合剂包括亲和素。
6.权利要求5所述的方法，其中所述结合剂包括链霉亲和素。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其还包括：
(n)对所述与结合剂结合的cDNA分子进行模板转换；
(o)扩增所述cDNA分子以形成扩增的cDNA分子溶液；和
(p)将固相可逆固定化(SPRI)珠溶液引入所述扩增的cDNA分子溶液中，以去除小于200个碱基对的多核苷酸，其中SPRI珠溶液与扩增的cDNA分子溶液之比为约0.9:1至约0.7:1。
8.权利要求7所述的方法，其中SPRI珠溶液与裂解物之比为约0.875:1至约0.775:1，约0.85:1至约0.75:1，或约0.825:1至约0.725:1。
9.权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述SPRI珠溶液包含约2M至3MNaCl和约15％w/v至25％w/v的聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG的分子量为约7000g/mol至9000g/mol。
10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其还包括：
将共用衔接子序列添加到所述释放的cDNA分子的3’端，其中所述添加是在包含最多约10％w/v的聚乙二醇的溶液中进行的，并且其中所述聚乙二醇的分子量为约7000g/mol至9000g/mol。
11.权利要求10所述的方法，其中通过模板转换将所述共用衔接子序列添加到所述释放的cDNA分子的3’端。
12.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中重复步骤(j)足以在单个细胞中产生用于核酸的独特系列核酸标签的次数。
13.权利要求12所述的方法，其中所述次数选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95和100次。
14.权利要求1-13中任一项所述的方法，
其中所述步骤(b)的引物还包含第一特异性条形码；所述方法还包括：
(q)逆转录第二多个细胞内的RNA分子以在所述第二多个细胞内形成cDNA分子，其中逆转录所述RNA分子包括将特异性引物偶联到所述RNA分子，其中所述引物包含第二特异性条形码和聚(T)序列或随机序列中的至少一种，其中所述第一特异性条形码不同于所述第二特异性条形码，使得可以与来自所述第二多个细胞的cDNA分子比较，识别来自所述第一多个细胞的cDNA分子；
(r)将所述包含cDNA分子的第二多个细胞分成至少两个初级等分试样，所述至少两个初级等分试样包括第一初级等分试样和第二初级等分试样；
(s)向所述至少两个初级等分试样提供初级核酸标签，其中向所述第一初级等分试样提供的初级核酸标签不同于向所述第二初级等分试样提供的初级核酸标签；
(t)将所述至少两个初级等分试样中的每一个内的cDNA分子与所提供的初级核酸标签偶联；
(u)合并所述至少两个初级等分试样；
(v)将所述合并的初级等分试样分成至少两个次级等分试样，所述至少两个次级等分试样包括第一次级等分试样和第二次级等分试样；
(w)向所述至少两个次级等分试样提供次级核酸标签，其中向所述第一次级等分试样提供的次级核酸标签不同于向所述第二次级等分试样提供的次级核酸标签；
(x)将所述至少两个次级等分试样中的每一个内的cDNA分子与所提供的次级核酸标签偶联；和
(y)用随后的等分试样重复步骤(u)、(v)、(w)和(x)，其中所述最后的核酸标签包含捕获剂。
15.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述核酸标签中的每一个包含：
第一链，其包含：
包含3’端和5’端的条形码序列；和
分别在所述条形码序列的3’端和5’端侧翼的3’杂交序列和5’杂交序列；和
第二链，其包含：
与所述5’杂交序列和衔接子序列中的至少一个互补的第一部分；和
与所述3’杂交序列互补的第二部分。
16.权利要求1-15中任一项所述的方法，其还包括：
连接所述与cDNA分子结合的核酸标签中的至少两个。
17.权利要求16所述的方法，其中所述连接在所述第一多个细胞内进行。
18.权利要求1-17中任一项所述的方法，其还包括：
去除未结合的核酸标签。
19.权利要求1-15中任一项所述的方法，其还包括：
连接所述与释放的cDNA分子结合的核酸标签中的至少两个。
20.权利要求1-19中任一项所述的方法，其中来自单个细胞的大多数核酸标签结合的cDNA分子包含相同系列结合的核酸标签。
21.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述第一多个细胞选自哺乳动物细胞、酵母细胞和细菌细胞中的至少一种。
22.一种标记第一细胞内的核酸的方法，所述方法包括：
(a)通过使用以下中的至少一种逆转录RNA在包括所述第一细胞的多个细胞内产生互补DNA(cDNA)分子：
(i)第一逆转录引物，其包含5’突出端序列，其中所述第一逆转录引物被配置成逆转录具有聚(A)尾的RNA；和
(ii)第二逆转录引物，其包含5’突出端序列和随机六聚体、随机七聚体、随机八聚体、随机九聚体和随机十聚体中的至少一种；
(b)将所述多个细胞分成一定数量(n)的等分试样；
(c)向所述n个等分试样中的每一个提供多种核酸标签，每种核酸标签包含：
第一链，其包含从标记序列的3’端延伸的3’杂交序列，和从标记序列的5’端延伸的5’杂交序列，和
第二链，其包含突出端序列，所述突出端序列包含：(i)与所述5’杂交序列和5’突出端序列中的至少一个互补的第一部分，和(ii)与所述3’杂交序列互补的第二部分，
其中向给定等分试样中提供的多个核酸标签的每个标记序列是相同的，并且其中向n个等分试样中的每一个中提供不同的标记序列；
(d)使所述n个等分试样中的每一个中的cDNA分子中的至少一种结合于核酸标签；
(e)合并所述n个等分试样；和
(f)用所述合并的等分试样重复步骤(b)、(c)、(d)和(e)；
(g)合并最后的等分试样；
(h)裂解所述包括第一细胞的多个细胞以从所述包括第一细胞的多个细胞内释放cDNA分子，以形成裂解物；和
(i)向所述裂解物添加蛋白酶抑制剂和结合剂，以使所述cDNA分子结合结合剂。
23.权利要求22所述的方法，其中重复步骤(f)足以在所述第一细胞中产生用于所述cDNA分子的独特系列标记序列的次数。
24.权利要求23所述的方法，其中所述次数选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95和100次。
25.权利要求22-24中任一项所述的方法，其中在等分试样中产生所述cDNA分子，其中所述等分试样中的第一逆转录引物的浓度为约0.5μM至约10μM，并且其中所述等分试样中的第二逆转录引物的浓度为约0.5μM至约10μM。
26.权利要求22-25中任一项所述的方法，其还包括：
在步骤(a)之前固定所述多个细胞，其中在约8℃以下固定所述多个细胞。
27.权利要求26所述的方法，其中在约7℃以下、在约6℃以下、在约5℃以下、在约4℃以下、在约3℃以下、在约2℃以下或在约1℃以下固定所述多个细胞。
28.权利要求22-27中任一项所述的方法，其还包括：
在步骤(a)之前透化所述多个细胞，其中在约8℃以下透化所述多个细胞。
29.权利要求28所述的方法，其中在约7℃以下、在约6℃以下、在约5℃以下、在约4℃以下、在约3℃以下、在约2℃以下或在约1℃以下透化所述多个细胞。
30.权利要求22-29中任一项所述的方法，其还包括：
连接所述与cDNA分子结合的核酸标签中的至少两个。
31.权利要求30所述的方法，其中所述连接在所述多个细胞内进行。
32.权利要求22-31中任一项所述的方法，其还包括：
去除未结合的核酸标签。
33.权利要求22-32中任一项所述的方法，其中所述第一和第二逆转录引物中的至少一个被配置成逆转录预定的RNA。
34.权利要求22-33中任一项所述的方法，其中所述最后的核酸标签包含捕获剂，并且其中所述方法还包括：
在步骤(f)之后，裂解所述多个细胞以从所述多个细胞内释放cDNA分子，以形成裂解物；和
向所述裂解物添加蛋白酶抑制剂和结合剂，以分离所述cDNA分子。
35.权利要求34所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂包括苯甲基磺酰氟(PMSF)或4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)。
36.权利要求34或权利要求35所述的方法，其中所述捕获剂包括生物素，并且其中所述结合剂包括亲和素。
37.权利要求36所述的方法，其中所述结合剂包括链霉亲和素。
38.权利要求22-37中任一项所述的方法，其还包括：
(j)对所述与结合剂结合的cDNA分子进行模板转换；
(k)扩增所述cDNA分子以形成扩增的cDNA分子溶液；和
(l)将固相可逆固定化(SPRI)珠溶液引入所述扩增的cDNA分子溶液，以去除小于200个碱基对的多核苷酸，其中SPRI珠溶液与扩增的cDNA分子溶液之比为约0.9:1至约0.7:1。
39.权利要求38所述的方法，其中SPRI珠溶液与裂解物之比为约0.875:1至约0.775:1，约0.85:1至约0.75:1，或约0.825:1至约0.725:1。
40.权利要求38或权利要求39所述的方法，其中所述SPRI珠溶液包含约2M至3MNaCl和约15％w/v至25％w/v的聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG的分子量为约7000g/mol至9000g/mol。
41.权利要求22-40中任一项所述的方法，其还包括：
将共用衔接子序列添加到所述释放的cDNA分子的3’端，其中所述添加是在包含最多约10％w/v的聚乙二醇的溶液中进行的，并且其中所述聚乙二醇的分子量为约7000g/mol至9000g/mol。
42.权利要求41所述的方法，其中通过模板转换将所述共用衔接子序列添加到所述释放的cDNA分子的3’端。
43.权利要求22-42中任一项所述的方法，其还包括：
连接所述与释放的cDNA分子结合的核酸标签中的至少两个。
44.权利要求22-43中任一项所述的方法，其中所述多个细胞选自哺乳动物细胞、酵母细胞和细菌细胞中的至少一种。
45.一种用于标记第一细胞内的核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：
第一逆转录引物，其包含5’突出端序列，其中所述第一逆转录引物被配置成逆转录具有聚(A)尾的RNA；
第二逆转录引物，其包含5’突出端序列和随机六聚体、随机七聚体、随机八聚体、随机九聚体和随机十聚体中的至少一种；
多个第一核酸标签，其中每个第一核酸标签包含：
第一链，其包含从第一标记序列的3’端延伸的3’杂交序列，和从第一标记序列的5’端延伸的5’杂交序列，和
第二链，其包含突出端序列，所述突出端序列包含：(i)与所述第一和第二逆转录引物的5’杂交序列和5’突出端序列中的至少一个互补的第一部分，和(ii)与所述3’杂交序列互补的第二部分；
多个第二核酸标签，其中每个第二核酸标签包含：
第一链，其包含从第二标记序列的3’端延伸的3’杂交序列，和从第二标记序列的5’端延伸的5’杂交序列，和
第二链，其包含突出端序列，所述突出端序列包含：(i)与所述第一和第二逆转录引物的5’杂交序列和5’突出端序列中的至少一个互补的...
【专利技术属性】
技术研发人员：G·希莉格，A·B·罗森伯格，C·若克，
申请(专利权)人：华盛顿大学，
类型：发明
国别省市：美国;US
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