西藏灵芝多糖GLP-3及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了西藏灵芝多糖GLP‑3及其制备方法与应用，所述西藏灵芝多糖GLP‑3提取于西藏灵芝粉末，其多糖含量为98.8％，重均分子量为159.7kDa，不含蛋白，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖组成，其中葡萄糖的摩尔占比为92.7％，具有‑OH、C‑H、C＝O以及α‑异构吡喃糖的特征吸收峰。本发明专利技术首次从西藏灵芝中分离制备出西藏灵芝多糖GLP‑3，制备方法加入超滤步骤，直接按照多糖的分子量进行初步分离，降低了后续纯化的难度，且得到的多糖纯度较高；得到的多糖GLP‑3可显著促进巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的能力，显著促进巨噬细胞RAW264.7产生NO、细胞因子和趋化因子，在免疫调节活性方面具有很好的食用和药用价值。

【技术实现步骤摘要】
西藏灵芝多糖GLP-3及其制备方法与应用
本专利技术涉及灵芝类多糖研究领域，具体涉及一种西藏灵芝多糖GLP-3及其制备方法与应用。
技术介绍
灵芝(GanodermalucidumKarst)又称林中灵、琼珍，是多孔菌科真菌灵芝的子实体，隶属于真菌门(Eumycota)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、曾菌纲(Hymenomycetes)、多孔菌目(Aphyllophorales)、灵芝科(Gamodermataceae)、灵芝属(Ganoderma)类。灵芝药用在中国已有2000多年的历史，被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品。2000年，已知灵芝属(Ganoderma)真菌约100余种，分布最广的为赤芝(G.lucidum)，其次为紫芝(G.japonicum)，还有树舌(G.applanatum)、松杉灵芝(G.tsugae)和簿树芝(G.capense)等均供药用。经过大量临床研究，灵芝对神经衰弱、高脂血症、冠心病、心律失常、克山病、高原不适症、肝炎、出血热、消化不良、气管炎等各有不同程度的疗效。灵芝分类历史悠久，归类各有不同，《本草纲目》等古籍中以“六色”将灵芝归为：青芝、赤芝、黄芝、白芝、黑芝、紫芝。2015年，广东省微生物研究所李泰辉等人在真菌学杂志《Mycoscience》发表文章宣布他们在西藏林芝地区发现了一个灵芝新种-西藏灵芝Ganodermaleucocontextum。自此之后针对西藏灵芝的食用及药用价值急需进行系统研究。从20世纪50年代开始，多糖因其独特的生理活性以及安全无毒的特点而受到广泛的关注，到60年代作为光谱免疫促进剂而逐渐成为研究的热点。到如今，已有300多种多糖类化合物被提取以及完成结构鉴定，并作为辅助治疗或直接治疗的药物。研究表明，众多的真菌多糖都具有免疫调节作用。作为一种天然免疫调节剂，真菌多糖不仅可以激活巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞、细胞毒T细胞以及自然杀伤细胞等免疫细胞，还能促进多种细胞因子(如TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-2)的释放和趋化因子的表达，促进抗体的合成，激活补体系统等。此外，真菌多糖还能对红细胞免疫系统、中性粒细胞免疫系统以及神经内分泌免疫功能产生一定程度的影响。但现有技术中,对西藏灵芝多糖新成分的研究成果甚少,而且还未见通过超滤等方法分离西藏灵芝多糖，以及关于西藏灵芝多糖在免疫调节功效方面的报道。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术旨在提供一种西藏灵芝多糖GLP-3及其制备方法与应用，以西藏灵芝为研究对象，对其分子量>100kDa的多糖进行分离纯化和生物活性研究，发现西藏灵芝多糖(>100kDa)的结构,以及其在免疫调节方面的食用和药用价值。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：西藏灵芝多糖GLP-3，其基本重复单元的结构如下：优选的，所述西藏灵芝多糖GLP-3的多糖含量为98.8％，重均分子量为159.7kDa。优选的，所述西藏灵芝多糖GLP-3不含蛋白，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖组成，其中葡萄糖的摩尔占比为92.7％。优选的，所述西藏灵芝多糖GLP-3具有-OH、C-H、C＝O以及α-异构吡喃糖的特征吸收峰。本专利技术还提供如上所述的西藏灵芝多糖GLP-3的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)西藏灵芝粉末经脱脂，得到西藏灵芝脱脂粉末；(2)往西藏灵芝脱脂粉末中加水，提取多次，得水提液，水提液减压浓缩，得浓缩液；(3)浓缩液经沉淀，然后除蛋白，并经透析、冷冻干燥后获得粗多糖；(4)取粗多糖配置成粗多糖溶液，将粗多糖溶液进行超滤，将超滤物冻干后，得到西藏灵芝多糖CGLP-3；(5)取西藏灵芝多糖CGLP-3配置成西藏灵芝多糖CGLP-3溶液，西藏灵芝多糖CGLP-3溶液经离子交换柱分离洗脱；(6)将洗脱后的溶液经降压浓缩，再经分子筛分离，再用一级水洗脱，采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，将出现峰的10-17管溶液合并，合并后的溶液经浓缩、透析、冷冻干燥后得到西藏灵芝多糖GLP-3。优选的，步骤(1)包括：向西藏灵芝粉末中加入95％乙醇，按照料液比1:20，75℃提取2h，重复操作一次，最后将西藏灵芝烘干，得到西藏灵芝脱脂粉末；步骤(2)包括：西藏灵芝脱脂粉末加水，按照料液比1:20，90℃提取2h，过滤后得水提液，重复操作2次，60℃减压浓缩，得浓缩液；步骤(3)包括：向浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，4℃下静置16h沉淀多糖，离心收集沉淀，离心转速为6000rpm，离心时间为10min，将沉淀物溶解于一级水中，得多糖溶液；向多糖溶液中加入1/3倍体积的Sevage试剂，所述Sevage试剂为氯仿:正丁醇＝4:1，剧烈震荡30min，4℃下离心，离心转速为6000rpm，离心时间为10min，取上清液，重复操作，直到完全去除蛋白；随后将去除蛋白的多糖溶液采用5000Da透析袋透析72h，之后冷冻干燥得到粗多糖。优选的，步骤(4)包括：取粗多糖1.5g，配置成浓度为3mg/mL的溶液，使用100kDa超滤膜进行超滤，冻干后，得到分子量>100kDa的西藏灵芝多糖CGLP-3；步骤(5)包括：取西藏灵芝多糖CGLP-360mg，配置成浓度为10mg/mL的溶液，经DEAE纤维素离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0mol/L的NaCl溶液洗脱，洗脱流速为2mL/min，洗脱时间为4min/管，之后用全自动部分收集器收集，并采用苯酚-硫酸法检测多糖的含量；步骤(6)包括：将由0.1mol/LNaCl洗脱下来的溶液，经60℃降压浓缩后，再经SephacrylS-300分子筛分离，用一级水洗脱，洗脱流速为1mL/min，洗脱时间为8min/管，之后采用全自动部分收集器收集，并采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，最后将出现峰的10-17管合并，经浓缩、透析、冷冻干燥后得到西藏灵芝多糖GLP-3。上述方法中，步骤(5)是根据多糖所带电荷进行分离，步骤(6)是根据多糖分子量进行分离。目前多糖的分离方法较多，包括使用离子交换柱或使用分子筛分离等，但单一的分离方法得到的多糖往往不够均一。而本专利技术在离子交换柱和分子筛之前加了超滤的步骤，这样就可以预估多糖的大概分子量，对后续分子筛填料选择具有关键性作用。本专利技术还提供如上所述的西藏灵芝多糖GLP-3在制备免疫调节剂药物中的应用。本专利技术还提供如上所述的西藏灵芝多糖GLP-3在制备具有促进巨噬细胞吞噬作用和/或增加巨噬细胞NO产生量和/或增加巨噬细胞的细胞因子和趋化因子产生量功效的免疫调节剂药物中的应用。所述免疫调节剂可被天然免疫受体TLR2识别，通过促进巨噬细胞的NO和/或细胞因子和/或趋化因子的产生量发挥其免疫调节功能。优选的，细胞因子包括TNF-α、IL-6、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-10；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种西藏灵芝多糖GLP-3,其特征在于,其基本重复单元的结构如下：/n

【技术特征摘要】
1.一种西藏灵芝多糖GLP-3,其特征在于,其基本重复单元的结构如下：





2.根据权利要求1所述的西藏灵芝多糖GLP-3，其特征在于，其多糖含量为98.8％，重均分子量为159.7kDa。


3.根据权利要求1所述的西藏灵芝多糖GLP-3，其特征在于，其不含蛋白，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖组成，其中葡萄糖的摩尔占比为92.7％。


4.根据权利要求1所述的西藏灵芝多糖GLP-3，其特征在于，其具有-OH、C-H、C＝O以及α-异构吡喃糖的特征吸收峰。


5.一种如权利要求1～4任一项所述的西藏灵芝多糖GLP-3的制备方法,其特征在于,包括以下步骤：
(1)西藏灵芝粉末经脱脂，得到西藏灵芝脱脂粉末；
(2)往西藏灵芝脱脂粉末中加水，提取多次，得水提液，水提液减压浓缩，得浓缩液；
(3)浓缩液经沉淀，然后除蛋白，并经透析、冷冻干燥后获得粗多糖；
(4)取粗多糖配置成粗多糖溶液，将粗多糖溶液进行超滤，将超滤物冻干后，得到西藏灵芝多糖CGLP-3；
(5)取西藏灵芝多糖CGLP-3配置成西藏灵芝多糖CGLP-3溶液，西藏灵芝多糖CGLP-3溶液经离子交换柱分离洗脱；
(6)将洗脱后的溶液经降压浓缩，再经分子筛分离，再用一级水洗脱，采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，将10-17管溶液合并，合并后的溶液经浓缩、透析、冷冻干燥后得到西藏灵芝多糖GLP-3。


6.根据权利要求5所述的西藏灵芝多糖GLP-3的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括：向西藏灵芝粉末中加入95％乙醇，按照料液比1:20，75℃提取2h，重复操作一次，最后将西藏灵芝烘干，得到西藏灵芝脱脂粉末；
步骤(2)包括：西藏灵芝脱脂粉末加水，按照料液比1:20，90℃提取2h，过滤后得水提液，重复操作2次，60℃减压浓缩，得浓缩液；
步骤(3)包括：向浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，4℃下静置16h沉淀多糖，离心收集沉淀，离心转速为600...

【专利技术属性】
技术研发人员：高雄，穆静静，谢意珍，胡惠萍，莫伟鹏，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，广东粤微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44