一种抗体药物偶联物平均偶联率及药物分布情况的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种抗体药物偶联物平均偶联率和药物分布情况的检测方法，根据抗体药物偶联物还原后分子的大小进行分离，不仅可以分析抗体药物偶联物的平均偶联率，还可对小分子药物linker‑drug在抗体上的分布情况进行分析。该方法适用大部分氨基偶联、巯基偶联和定点偶联等方式得到的抗体药物偶联物。

A test method for the average coupling rate and drug distribution of antibody drug conjugates

【技术实现步骤摘要】
一种抗体药物偶联物平均偶联率及药物分布情况的检测方法
]本专利技术涉及抗体药物偶联物检测领域，具体涉及一种新的检测抗体药物偶联物的平均偶联率的方法，本专利技术还涉及该方法在测定抗体药物偶联物药物分布情况中的应用。
技术介绍
抗体药物偶联物(又称AntibodyDrugConjugates,ADCs)，是由抗体(antibody)、药物(Drug)以及连接子(linker)三部分组成，它将抗体的靶向性与药物的抗肿瘤作用完美的结合在一起。抗体药物偶联物因其良好的靶向性及抗肿瘤活性，可实现“精准治疗”，已成为抗肿瘤抗体药物研发的新热点和重要趋势，受到越来越多的关注。平均偶联率和药物分布情况是描述抗体药物偶联物药物特征的重要理化参数，它决定了药物“弹头”的“载弹量”，同时影响着药物的安全性和有效性。平均偶联率(即DAR值)是指测量体系中总的药物分子和抗体分子的摩尔浓度之比。药物分布情况是指具有不同DAR值的抗体药物偶联物分子分别占总的抗体药物偶联物分子的比例，或者抗体轻链或重链上偶联不同数量药物的分子占总轻链或总重链的比例。目前，常见的平均偶联率和药物分布情况的分析方法包括：紫外分光光度法(UV法)、疏水作用色谱法(HIC-HPLC法)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC法)及质谱法(LC-MS法)，其中：(1)UV法是基于朗伯比尔定律对DAR值进行测定，是最为简单的方法，采用该方法必须具备三个条件：①药物具有足够的吸光度；②药物和抗体有明显不同的最大吸收波长；③药物与抗体结合不会影响到这两个组分各自的光吸收特性，这样就可以将不同组分的吸光值简单相加。该方法简单且不需要进行分离；但缺点在于不够精确，且仅能得到体系的平均偶联率，而无法得到药物分布情况信息。(2)疏水作用色谱法(HIC-HPLC)根据抗体偶联上药物后疏水性的不同而进行分离，通过色谱峰面积百分比和对应的载药数计算平均偶联率，同时可对药物的分布情况进行分析，得出偶联不同数量药物抗体药物偶联物组分的比例，但对于小分子药物和抗体的疏水性没有差别的抗体药物偶联物无能为力。(3)反相高效液相色谱法一般需要通过还原反应解离抗体的轻链和重链，根据极性的大小分离含不同数量药物分子的轻链和重链，利用各色谱峰的峰面积和对应的载药数进行计算，可以得到抗体药物偶联物的平均偶联率，以及轻链和重链上药物的分布情况进行分析，但对于不同组分极性差别较小的抗体药物偶联物无法进行分析。(4)质谱法通过质荷比可以辨认出质谱图上偶联不同数量药物的抗体药物偶联物的峰，然后根据各峰的峰面积可以得出各自的相对含量，并计算平均偶联率值。但质谱法分析的前提是无论药物载量的高低，都假定所有物质同未偶联抗体具有相同的离子化效率。因此，应用质谱技术分析DAR值的前提是假定所有物质具有相同的回收率和电离情况，而实际情况并非总是如此，因为药物与带正电的胺的偶联将导致所带电荷和疏水程度的改变。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种新的检测抗体药物偶联物平均偶联率的方法：rCE-SDS法，本专利技术还提供了上述检测方法在检测抗体药物偶联物药物分布情况中的应用。具体的，本专利技术提供了一种抗体药物偶联物平均偶联率检测方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：a.试剂的准备：(1)SDS样品缓冲液:含1％SDS的0.1mol/LTris-HCl溶液，pH9.0；(2)SDS凝胶分离缓冲液:含0.2％SDS缓冲液，pH8.0；(3)0.1mol/L盐酸溶液；(4)0.1mol/L氢氧化钠溶液；b.供试品制备：将供试品稀释至4mg/mL，取25μL，加入SDS样品缓冲液70μL，加入适量硫醇类还原剂，使供试品的终浓度为1-2mg/mL。68-72℃孵育10min，冷却离心取上清液用于分析；c.检测准备：(1)检测波长:280nm；(2)毛细管:非涂层-熔融石英毛细管，内径50μm，有效长度为20.0-24.5cm；(3)检测窗：100×800μm；(4)样品室温度：18-22℃；(5)毛细管温度：18-22℃；所述的毛细管通过以下步骤进行预处理：0.1mol/L氢氧化钠溶液在20psi压力下冲洗10min；0.1mol/L盐酸溶液在20psi压力下冲洗5min；超纯水在20psi压力下冲洗2min；用SDS凝胶分离缓冲液在70psi的压力下冲洗10分钟；d.供试品分析：(1)0.1mol/L氢氧化钠溶液在70psi压力下冲洗3min；(2)0.1mol/L盐酸溶液在70psi压力下冲洗1min；(3)超纯水在70psi压力下冲洗1min；(4)用SDS凝胶分离缓冲液在70psi的压力下冲洗10分钟；(5)用超纯水蘸洗毛细管后，-5kV电压下进样20s；(6)-15kV电压分离30min，毛细管两端保持20psi的压力；e.抗体药物偶联物平均偶联率的确定：根据公式：DAR＝DARLC+DARHC，得到抗体药物偶联物平均欧联率DAR值；其中：DARLC＝2×LC1％/(LC％+LC1％)；DARHC＝2×(HC1％+2×HC2％+3×HC3％)/(HC％+HC1％+HC2％+HC3％)；DARLC代表抗体药物偶联物轻链的平均偶联率；DARHC代表抗体药物偶联物重链的平均偶联率；LC1％代表抗体药物偶联物偶联一个linker-drug的轻链的rCE-SDS色谱峰校正峰面积百分比；LC％代表抗体药物偶联物轻链的rCE-SDS色谱峰校正峰面积百分比；HC1％代表抗体药物偶联物偶联一个linker-drug的重链的rCE-SDS色谱峰校正峰面积百分比；HC2％代表抗体药物偶联物偶联两个linker-drug的重链的rCE-SDS色谱峰校正峰面积百分比；HC3％代表抗体药物偶联物偶联三个linker-drug的重链的rCE-SDS色谱峰校正峰面积百分比；HC％代表抗体药物偶联物重链的rCE-SDS色谱峰校正峰面积百分比。进一步的，所述的硫醇类还原剂选自β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)磷(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)。优选的，所述的硫醇类还原剂为β-巯基乙醇。优选的，所述的硫醇类还原剂为三(2-羧乙基)磷；进一步的，所述的三(2-羧乙基)磷的浓度为0.1mol/L。优选的，所述的硫醇类还原剂为二硫苏糖醇；进一步的，所述的二硫苏糖醇的浓度为1mol/L。进一步的，所述硫醇类还原剂的使用量为4-6μL；优选的，所述硫醇类还原剂的使用量为5μL。进一步的，步骤b中加入SDS样品缓冲液和硫醇类还原剂后供试品的终浓度为1mg/mL。进一步的，所用的毛细管电泳仪配备的检测器为紫外检测器(VWD)或二级管阵列检测器(PDA/DAD)。进一步的，所用的毛细管有效长度为20.0cm。进一步的，所述的抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗体药物偶联物平均偶联率检测方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：/na.试剂的准备：/n(1)SDS样品缓冲液:含1％SDS的0.1mol/LTris-HCl溶液，pH9.0；/n(2)SDS凝胶分离缓冲液:含0.2％SDS缓冲液，pH8.0；/n(3)0.1mol/L盐酸溶液；/n(4)0.1mol/L氢氧化钠溶液；/nb.供试品制备：将供试品稀释至4mg/mL，取25μL，加入SDS样品缓冲液70μL，加入适量硫醇类还原剂，使供试品的终浓度为1-2mg/mL，68-72℃孵育10min，冷却离心取上清液用于分析；/nc.检测准备：/n(1)检测波长:280nm；/n(2)毛细管:非涂层-熔融石英毛细管，内径50μm，有效长度为20.0-24.5cm；/n(3)检测窗：100×800μm；/n(4)样品室温度：18-22℃；/n(5)毛细管温度：18-22℃；/n所述的毛细管通过以下步骤进行预处理：0.1mol/L氢氧化钠溶液在20psi压力下冲洗10min；0.1mol/L盐酸溶液在20psi压力下冲洗5min；超纯水在20psi压力下冲洗2min；用SDS凝胶分离缓冲液在70psi的压力下冲洗10分钟；/nd.供试品分析：/n(1)0.1mol/L氢氧化钠溶液在70psi压力下冲洗3min；/n(2)0.1mol/L盐酸溶液在70psi压力下冲洗1min；/n(3)超纯水在70psi压力下冲洗1min；/n(4)用SDS凝胶分离缓冲液在70psi的压力下冲洗10分钟；/n(5)用超纯水蘸洗毛细管后，-5kV电压下进样20s；/n(6)-15kV电压分离30min，毛细管两端保持20psi的压力；/ne.抗体药物偶联物平均偶联率的确定：/n根据公式：DAR＝DAR...

【技术特征摘要】
1.一种抗体药物偶联物平均偶联率检测方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
a.试剂的准备：
(1)SDS样品缓冲液:含1％SDS的0.1mol/LTris-HCl溶液，pH9.0；
(2)SDS凝胶分离缓冲液:含0.2％SDS缓冲液，pH8.0；
(3)0.1mol/L盐酸溶液；
(4)0.1mol/L氢氧化钠溶液；
b.供试品制备：将供试品稀释至4mg/mL，取25μL，加入SDS样品缓冲液70μL，加入适量硫醇类还原剂，使供试品的终浓度为1-2mg/mL，68-72℃孵育10min，冷却离心取上清液用于分析；
c.检测准备：
(1)检测波长:280nm；
(2)毛细管:非涂层-熔融石英毛细管，内径50μm，有效长度为20.0-24.5cm；
(3)检测窗：100×800μm；
(4)样品室温度：18-22℃；
(5)毛细管温度：18-22℃；
所述的毛细管通过以下步骤进行预处理：0.1mol/L氢氧化钠溶液在20psi压力下冲洗10min；0.1mol/L盐酸溶液在20psi压力下冲洗5min；超纯水在20psi压力下冲洗2min；用SDS凝胶分离缓冲液在70psi的压力下冲洗10分钟；
d.供试品分析：
(1)0.1mol/L氢氧化钠溶液在70psi压力下冲洗3min；
(2)0.1mol/L盐酸溶液在70psi压力下冲洗1min；
(3)超纯水在70psi压力下冲洗1min；
(4)用SDS凝胶分离缓冲液在70psi的压力下冲洗10分钟；
(5)用超纯水蘸洗毛细管后，-5kV电压下进样20s；
(6)-15kV电压分离30min，毛细管两端保持20psi的压力；
e.抗体药物偶联物平均偶联率的确定：
根据公式：DAR＝DARLC+DARHC，得到抗体药物偶联物平均偶联率DAR值；
DARLC＝2×LC1％/(LC％+LC1％)；
DARHC＝2×(HC1％+2×HC2％+3×HC3％)/(HC％+HC1％+HC2％+HC3％)；
其中：
DARLC代表抗体药物偶联物轻链的平均偶联率；
DARHC代表抗体药物偶联物重链的平均偶联率；
LC1％代表抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔娜娜，黄长江，周秀秀，汤鸿武，丁丁，
申请(专利权)人：烟台迈百瑞国际生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37