一种自然杀伤细胞体外培养方法技术

本发明专利技术涉及生物制药技术领域，具体涉及一种自然杀伤细胞体外培养方法，该方法将整个培养过程分为诱导培养和增殖培养两个阶段，诱导培养采用透明质酸和CD16抗体对培养瓶预包被，培养过程中加入维生素E和槲皮素；增殖培养采用芝麻素和RetroNectin对培养瓶预包被，培养过程中加入谷胱甘肽和卟啉‑α；培养瓶的包被成分、添加的助剂成分与各阶段培养基中的有效成分相互配合作用，协同增效促进NK细胞的活化和增殖，在提高NK细胞的扩增效率的同时，提高NK细胞的活性。

A culture method of natural killer cells in vitro

【技术实现步骤摘要】
一种自然杀伤细胞体外培养方法
本专利技术涉及生物制药
，具体涉及一种自然杀伤细胞体外培养方法。
技术介绍
人体免疫系统是由一个复杂的机制调节的，当免疫系统发生异常时，可能会引起免疫系统的失衡，并可能发生癌症等各种难治疗的疾病。因此，免疫细胞疗法的发展成为人们关注的焦点，它是一种通过缓解免疫系统失衡并恢复正常状态来治疗免疫相关疾病的方法。自然杀伤细胞（NK）是人体免疫细胞的一种，来源于骨髓淋巴细胞。在人体中，NK细胞主要分布在外周血和脾脏中，大致占外周血淋巴细胞的5%~15%；同时，也少量存在于淋巴结等其他组织中。NK细胞相对于其他类型的淋巴细胞，具有其自身的独特性质。其最重要的特性是NK细胞不表达特异性抗原识别受体。因此，NK细胞在杀伤靶细胞的过程中，不需要通过特异性的机制识别靶细胞，是人体快速抵抗外源物质入侵的第一道防线，可以广谱地杀灭各种病原物。同时，NK细胞的杀伤作用不受主要组织相容性复合体的限制，可以对多种肿瘤细胞迅速杀伤和溶解。近年来有大量的临床研究表明NK细胞在抵抗肿瘤和病毒感染方面具有非常重要的作用。由于在外周血淋巴细胞中NK细胞含量只有10%左右，因此在临床应用的NK细胞通常需要通过体外培养的方法进行扩大培养以满足临床用量。体外培养常规方法是采用高剂量IL-2扩增NK细胞，只能扩增几十倍，并且需要抽取患者大量的外周血，才能够达到治疗所需的细胞数量。因此，近年来，人们针对提高NK细胞体外培养效率进行了大量的研究，包括在培养基中加入IL-5、IL-21、GM-CSF等诱导因子和增值因子。这些针对培养基改进的方式虽然在一定程度上提高了NK细胞的扩增效率，但是将体外培养的NK细胞注射如体内发挥其免疫功能还需要确保NK细胞具有高的活性。由此，如何在提高NK细胞提高扩增效率的同时，防止细胞死亡和老化，保持细胞的活性，成为了目前亟待解决的技术问题。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的是提供一种自然杀伤细胞体外培养方法，具有高的扩增效率，保持细胞活性。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种自然杀伤细胞体外培养方法，包括以下操作步骤：1）制备单个核细胞悬浮液：将分离获得外周血单个核细胞重悬于诱导培养基中，得到单个核细胞悬浮液；2）诱导培养：在培养瓶中加入透明质酸和CD16抗体对培养瓶进行包被，作为诱导培养用培养瓶；将步骤1）的单个核细胞悬浮液接种至诱导培养用培养瓶中，培养24小时，培养过程中及时补充诱导培养基，并且每间隔6小时，向培养瓶中加入维生素E和槲皮素，获得诱导培养悬浮液；3）增殖培养：在新的培养瓶中加入芝麻素和RetroNectin对培养瓶进行包被，作为增殖培养用培养瓶；将步骤2）获得的诱导培养悬浮液接种至增殖培养用培养瓶中，在增殖培养基环境下培养14天，培养过程中及时补充增殖培养基，并且每间隔2~3天，向培养瓶中加入谷胱甘肽和卟啉-α，即完成；其中诱导培养基的组成包括基础培养基、IL-2、IL-5、自体血清、氨基酸；增殖培养基的组成包括基础培养基、IL-15、GM-CSF、自体血清、氨基酸。进一步的，步骤2）中在培养瓶中加入透明质酸和CD16抗体对培养瓶进行包被的具体方法包括取生理盐水，加入透明质酸和CD16抗体，配置成含有3~6mg/ml透明质酸和5~8μg/mlCD16抗体的包被液，在培养瓶中加入5~10ml的PBS、1~2ml的包被液，4℃过夜后，弃去包被液，用PBS洗涤，即完成。进一步的，步骤3）中在培养基中加入芝麻素和RetroNectin对培养瓶进行包被的具体方法包括取生理盐水，加入芝麻素和RetroNectin，配置成含有50~60μg/ml芝麻素和5~8μg/mlRetroNectin的包被液，在培养瓶中加入5~10ml的PBS、1~2ml的包被液，4℃过夜后，弃去包被液，用PBS洗涤，即完成。进一步的，诱导培养基的具体组成为：DMEM培养基，5%自体血清，1%谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，500~750IU/mlIL-2，35~60mg/mlIL-5；增殖培养基的具体组成为：Cellgro-SCGM培养基，5%自体血清，1%谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，25~50ng/mlIL-15，0.5~1μg/mlGM-CSF。进一步的，步骤2）中根据培养瓶中培养基的体积，向培养瓶中加入维生素E的用量为10~20mg/ml，加入槲皮素的用量为15~20μg/ml。进一步的，步骤3）中根据培养瓶中培养基的体积，向培养瓶中加入谷胱甘肽的用量为5~10μg/ml，加入卟啉-α的用量为0.6~1μg/ml。进一步的，步骤1）制备单个核细胞悬浮液的具体方法包括无菌采外周血，用缓冲液稀释外周血后，加入Ficoll分离液，离心后洗涤，得到外周血单个核细胞，将外周血单个核细胞按照一定的浓度用诱导培养基进行重悬，即完成。本专利技术自然杀伤细胞体外培养方法，将整个培养过程分为诱导培养和增殖培养两个阶段，诱导培养采用透明质酸和CD16抗体对培养瓶预包被，培养过程中加入维生素E和槲皮素；增殖培养采用芝麻素和RetroNectin对培养瓶预包被，培养过程中加入谷胱甘肽和卟啉-α；培养瓶的包被成分、添加的助剂成分与各阶段培养基中的有效成分相互配合作用，协同增效促进NK细胞的活化和增殖，在提高NK细胞的扩增效率的同时，提高NK细胞的活性。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。实施例1一种自然杀伤细胞体外培养方法，包括以下操作步骤：1）配置培养基：A：诱导培养基：取DMEM培养基，加入5%自体血清，1%谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，600IU/mlIL-2，45mg/mlIL-5；B：增殖培养基：取Cellgro-SCGM培养基，加入5%自体血清，1%谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，35ng/mlIL-15，0.7μg/mlGM-CSF；其中非必要氨基酸为丝氨酸和丙氨酸；2）制备单个核细胞悬浮液：无菌采外周血，用PBS缓冲液按照1：2的比稀释外周血；取离心管加入Ficoll分离液，然后将稀释后的外周血加入离心管中，离心后洗涤，得到外周血单个核细胞，将外周血单个核细胞按照5×105/ml的浓度用诱导培养基进行重悬；3）诱导培养：A：培养瓶的包被：取生理盐水，加入透明质酸和CD16抗体，配置成含有5mg/ml透明质酸和7μg/mlCD16抗体的包被液，在培养瓶中加入7ml的PBS、1.5ml的包被液，4℃过夜后，弃去包被液，用PBS洗涤；B：将步骤2）制备的单个核细胞悬浮液接种至完成包被的培养瓶中，培养过程中及时补充诱导培养基，并且每间隔6小时，向培养瓶中加入维生素E至浓度为15mg/ml，槲皮素至浓度为18μg/ml，培养24小时得诱导培养悬浮液；4）增殖培养：A：培养瓶的包被：取生理盐水，加入芝麻素和RetroNectin，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种自然杀伤细胞体外培养方法，其特征在于，包括以下操作步骤：/n1)制备单个核细胞悬浮液：/n将分离获得外周血单个核细胞重悬于诱导培养基中，得到单个核细胞悬浮液；/n2)诱导培养：/n在培养瓶中加入透明质酸和CD16抗体对培养瓶进行包被，作为诱导培养用培养瓶；将步骤1)的单个核细胞悬浮液接种至诱导培养用培养瓶中，培养24小时，培养过程中及时补充诱导培养基，并且每间隔6小时，向培养瓶中加入维生素E和槲皮素，获得诱导培养悬浮液；/n3)增殖培养：/n在新的培养瓶中加入芝麻素和RetroNectin对培养瓶进行包被，作为增殖培养用培养瓶；将步骤2)获得的诱导培养悬浮液接种至增殖培养用培养瓶中，在增殖培养基环境下培养14天，培养过程中及时补充增殖培养基，并且每间隔2～3天，向培养瓶中加入谷胱甘肽和卟啉-α，即完成；/n其中诱导培养基的组成包括基础培养基、IL-2、IL-5、自体血清、氨基酸；增殖培养基的组成包括基础培养基、IL-15、GM-CSF、自体血清、氨基酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种自然杀伤细胞体外培养方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
1)制备单个核细胞悬浮液：
将分离获得外周血单个核细胞重悬于诱导培养基中，得到单个核细胞悬浮液；
2)诱导培养：
在培养瓶中加入透明质酸和CD16抗体对培养瓶进行包被，作为诱导培养用培养瓶；将步骤1)的单个核细胞悬浮液接种至诱导培养用培养瓶中，培养24小时，培养过程中及时补充诱导培养基，并且每间隔6小时，向培养瓶中加入维生素E和槲皮素，获得诱导培养悬浮液；
3)增殖培养：
在新的培养瓶中加入芝麻素和RetroNectin对培养瓶进行包被，作为增殖培养用培养瓶；将步骤2)获得的诱导培养悬浮液接种至增殖培养用培养瓶中，在增殖培养基环境下培养14天，培养过程中及时补充增殖培养基，并且每间隔2～3天，向培养瓶中加入谷胱甘肽和卟啉-α，即完成；
其中诱导培养基的组成包括基础培养基、IL-2、IL-5、自体血清、氨基酸；增殖培养基的组成包括基础培养基、IL-15、GM-CSF、自体血清、氨基酸。


2.如权利要求1所述的自然杀伤细胞体外培养方法，其特征在于，步骤2)中在培养瓶中加入透明质酸和CD16抗体对培养瓶进行包被的具体方法包括取生理盐水，加入透明质酸和CD16抗体，配置成含有3～6mg/ml透明质酸和5～8μg/mlCD16抗体的包被液，在培养瓶中加入5～10ml的PBS、1～2ml的包被液，4℃过夜后，弃去包被液，用PBS洗涤，即完成。


3.如权利要求1所述的自然杀伤细胞体外培养方法，其特征在于，步骤3)中在培养基中加入芝麻素和RetroNectin对培养瓶进行包被的具...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小奇，张晓盈，黄睿龙，苏琳琳，孙向东，
申请(专利权)人：河南侨创生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41