一种多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法技术

本发明专利技术属于细胞培养技术领域，具体地说是一种多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法。一种多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法，包括如下步骤：(1)获取PBMC；(2)洗涤PBMC；(3)调整PBMC细胞浓度；(4)培养瓶处理；(5)第一次增殖培养；(6)第二次增殖培养；(7)第三次增殖培养；(8)第四次增殖培养；(9)第五次增殖培养。本发明专利技术通过筛选多种细胞因子对NK细胞共同诱导培养，从流式检测结果可以看出CD3+CD56+含量比第0天提高了86.2％，NK细胞数量增加了150倍。

A high purity NK cell culture method induced by multicellular factors

【技术实现步骤摘要】
一种多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法
本专利技术属于细胞培养
，具体地说是一种多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法。
技术介绍
NK细胞，即自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)是机体对抗病原体侵袭和正常细胞恶变的一种重要的天然免疫细胞，无需预先接触肿瘤特异性抗原即可杀伤肿瘤细胞，对肿瘤的增殖和转移扩散均具有“抑制”作用。NK细胞能够清除术后微小残留病灶，降低复发，因而被认为是肿瘤免疫治疗的重要免疫细胞。NK细胞具有广谱的肿瘤杀伤效果，伤机制包括：FasL与Fas相互作用、穿孔素/颗粒酶作用、借助表面CD16与肿瘤特异性IgG发生的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、肿瘤凋亡相关因子(TNF-α、IFN-β)的分泌作用。NK细胞除对靶细胞具有溶解杀伤作用外，NK细胞还在机体免疫反应中具有重要功能。NK细胞可通过对粒细胞、树突状细胞的调节作用而控制天然免疫力。NK细胞可以作用于CD4+T细胞和CD8+T细胞以强化获得性免疫。有研究表明肿瘤患者外周血NK细胞的活性与其痊愈后存在着密切关系，然而，NK细胞仅占外周血淋巴细胞的5-10％，且目前NK扩增的主要方法为单纯细胞因子刺激扩增法，其扩增效率及纯度较低，同时存在重复性差的缺点。
技术实现思路
专利技术提供了一种人细胞因子诱导的杀伤性细胞的培养方法，以克服目前NK扩增的主要方法为单纯细胞因子刺激扩增法，其扩增效率及纯度较低的问题。本专利技术提供的技术方案为：一种多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法，包括如下步骤：(1)获取PBMC：取肿瘤患者外周血50-60mL，利用淋巴细胞分离密度梯度离心法分离出PBMC；(2)洗涤PBMC：将步骤(1)所得PBMC细胞用基础培养基洗涤一次；(3)调整PBMC细胞浓度：用所述基础细胞培养基对步骤(2)所得的PBMC的细胞浓度进行调整；(4)培养瓶处理：将T175细胞培养瓶用包被液包被处理1-2h后，倒出包被液并用生理盐水润洗一遍；(5)第一次增殖培养：将步骤(3)所得PBMC置于步骤(4)所得T175细胞培养瓶中，并利用第一次增殖培养基增殖培养至第3d；(6)第二次增殖培养：补加第0d一倍体积的第二次增殖培养基增殖培养至第5d；(7)第三次增殖培养：补加第3d一倍体积的第三次增殖培养基增殖培养至第7d；(8)第四次增殖培养：将经过步骤(7)增殖培养后的细胞转入培养袋中，补加第四次增殖培养基至500mL继续增殖培养；(9)第五次增殖培养：每隔2-3d补加300-500mL的第五次增殖培养基300-500mL，第17-20d收获细胞。作为优选，步骤(3)中所得PBMC细胞浓度为1-2×106个/mL。作为优选，步骤(4)中包被液为0.01-5.0mg/mL的CD3单克隆抗体和0.010-5.0mg/mL的CD16单克隆抗体的混合液。作为优选，所述细胞基础培养基为ALys505N-0。作为优选，所述第一增殖培养基是以ALys505N-0培养基为基础培养基，灭活人体血清、IL-2、IL-12、IL-15和IL-18的含量分别为：5％-10％、500U/mL、20ng/mL、20ng/mL和20ng/mL。作为优选，所述第二增殖培养基和第三增殖培养基均是以ALys505N-0培养基为基础培养基，IL-2、IL-12、IL-15和IL-18的含量分别为：500U/mL、20ng/mL、20ng/mL和20ng/mL。作为优选，所述第四增殖培养基是以ALys505N-0培养基为基础培养基，IL-2、IL-12、IL-15和IL-18的含量分别为：500U/mL、10ng/mL、10ng/mL和10ng/mL。作为优选，所述第五增殖培养基是以ALys505N-0培养基为基础培养基，IL-2的含量为500U/mL。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术在培养NK细胞之前先用含有CD3单克隆抗体和CD16单克隆抗体对细胞培养瓶进行包被处理。CD3单克隆抗体和CD16单克隆抗体可直接作用于NK细胞，使其受到信号刺激，得到活化，促进相关细胞因子的合成。(2)本专利技术的NK细胞是由多种细胞因子共同诱导培养的细胞群，其中IL-2是体外扩增细胞体系中最早最常用的细胞因子，其可促进NK细胞的增殖和提高杀伤活性；IL-12是促进NK细胞毒性作用的最强细胞因子，其在浓度小于1pmol/L时就能明显增强NK细胞的杀伤活性；IL-15和IL-12都可以与IL-2受体复合体的β和γ链结合，故在生物学效应和信号转导上有许多相似之处，可以产生协同作用进一步提高其生物学效应；IL-18是一种无毒性的细胞因子，可以诱导NK细胞和T细胞分泌干扰素－γ，具有促进NK细胞增殖和活性。综上可以看出，本专利技术通过筛选多种细胞因子对NK细胞共同诱导培养，从流式检测结果可以看出CD3+CD56+含量比第0天提高了86.2％，NK细胞数量增加了150倍。具体实施方式参考下列实施例将更容易理解本专利技术，给出的实施例不是限制本专利技术的范围。实施例中采用的ALys505N-0培养基为日本CSTI公司的产品。实施例中的PBMC是指外周血单个核细胞。实施例1：一种多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法，包括如下步骤：(1)获取PBMC：取肿瘤患者外周血50-60mL，利用淋巴细胞分离密度梯度离心法分离出PBMC；(2)洗涤PBMC：将步骤(1)所得PBMC细胞用50mlALys505N-0培养基洗涤一次；(3)调整PBMC细胞浓度：用ALys505N-0培养基将步骤(2)所得的PBMC的细胞浓度调整为1-2×106个/mL；(4)培养瓶处理：将T175细胞培养瓶用含0.01-5.0mg/mL的CD3单克隆抗体和0.010-5.0mg/mL的CD16单克隆抗体的包被液包被处理1-2h，倒出包被液并用生理盐水润洗一遍；(5)第一次增殖培养：将步骤(3)所得PBMC置于步骤(4)所得T175细胞培养瓶中，用第一次增殖培养基增殖培养至第3d；所述第一增殖培养基是以ALys505N-0培养基为基础培养基，灭活人体血清、IL-2、IL-12、IL-15和IL-18的含量分别为：5％-10％、500U/mL、20ng/mL、20ng/mL和20ng/mL；(6)第二次增殖培养：补加第0d一倍体积的第二次增殖培养基增殖培养至第5d；(7)第三次增殖培养：补加第3d一倍体积的第三次增殖培养基增殖培养至第7d；所述第二增殖培养基和第三增殖培养基均是以ALys505N-0培养基为基础培养基，IL-2、IL-12、IL-15和IL-18的含量分别为：500U/mL、20ng/mL、20ng/mL和20ng/mL；(8)第四次增殖培养：将经过步骤(7)增殖培养后的细胞转入培养袋中，补加第四次增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：/n（1）获取PBMC：取肿瘤患者外周血50-60mL，利用淋巴细胞分离密度梯度离心法分离出PBMC；/n（2）洗涤PBMC：将步骤（1）所得PBMC细胞用基础培养基洗涤一次；/n（3）调整PBMC细胞浓度：用所述基础细胞培养基对步骤（2）所得的PBMC的细胞浓度进行调整；/n（4）培养瓶处理：将T175细胞培养瓶用包被液包被处理1-2h后，倒出包被液并用生理盐水润洗一遍；/n（5）第一次增殖培养：将步骤（3）所得PBMC置于步骤（4）所得T175细胞培养瓶中，并利用第一次增殖培养基增殖培养至第3d；/n（6）第二次增殖培养：补加第0d一倍体积的第二次增殖培养基增殖培养至第5d；/n（7）第三次增殖培养：补加第3d一倍体积的第三次增殖培养基增殖培养至第7d；/n（8）第四次增殖培养：将经过步骤（7）增殖培养后的细胞转入培养袋中，补加第四次增殖培养基至500mL继续增殖培养；/n（9）第五次增殖培养：每隔2-3d补加300-500mL的第五次增殖培养基300-500mL，第17-20d收获细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）获取PBMC：取肿瘤患者外周血50-60mL，利用淋巴细胞分离密度梯度离心法分离出PBMC；
（2）洗涤PBMC：将步骤（1）所得PBMC细胞用基础培养基洗涤一次；
（3）调整PBMC细胞浓度：用所述基础细胞培养基对步骤（2）所得的PBMC的细胞浓度进行调整；
（4）培养瓶处理：将T175细胞培养瓶用包被液包被处理1-2h后，倒出包被液并用生理盐水润洗一遍；
（5）第一次增殖培养：将步骤（3）所得PBMC置于步骤（4）所得T175细胞培养瓶中，并利用第一次增殖培养基增殖培养至第3d；
（6）第二次增殖培养：补加第0d一倍体积的第二次增殖培养基增殖培养至第5d；
（7）第三次增殖培养：补加第3d一倍体积的第三次增殖培养基增殖培养至第7d；
（8）第四次增殖培养：将经过步骤（7）增殖培养后的细胞转入培养袋中，补加第四次增殖培养基至500mL继续增殖培养；
（9）第五次增殖培养：每隔2-3d补加300-500mL的第五次增殖培养基300-500mL，第17-20d收获细胞。


2.根据权利要求1所述多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法，其特征在于，步骤（3）中所得PBMC细胞浓度为1-2×106个/mL。


3.根据权利要求1所述多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法，其特征在于，步骤（4）中包被液为0.01-5.0m...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫毅，梁红，吴曼惠，
申请(专利权)人：南宁摩米生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广西;45