本发明专利技术提出了一种培养基，所述培养基用于体外扩增恶性肿瘤腹水来源的免疫细胞。该培养基包括：基础培养基以及促增殖因子，所述基础培养基为RPMI‑1640，所述促增殖因子由重组人IL‑2以及Dynabeads人T细胞激活因子CD3/CD28组成。发明专利技术人发现，在腹水免疫细胞的体外增殖过程中，单独使用rhIL‑2比联合其他的细胞因子在促进腹水免疫细胞的体外增殖方面具有显著优势。根据本发明专利技术实施例的培养基用于腹水来源的免疫细胞的体外扩增，可短时间内大量获得具有免疫杀伤效果的免疫细胞。
【技术实现步骤摘要】
体外大量扩增恶性肿瘤腹水浸润的淋巴细胞的方法
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及体外大量扩增恶性肿瘤腹水浸润的淋巴细胞的方法，更具体地，本专利技术涉及培养基以及淋巴细胞的体外扩增方法。
技术介绍
免疫治疗是新兴的一种肿瘤治疗方式，已经被列为继手术、放疗、化疗后的第四种治疗方式，在肿瘤的综合治疗中逐渐发挥重要作用。2010年，美国FDA批准世界上第一个细胞免疫治疗产品Provenge上市，充分显示出细胞免疫治疗在肿瘤治疗中的价值。目前常用的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltratinglymphocyte，TIL)是存在于肿瘤间质内的以淋巴细胞为主的异质性淋巴细胞群体，大多聚集在肿瘤周围或其间质呈套状围绕癌巢。其主要成分是存在于肿瘤间质内的T淋巴细胞，小部分为MHC非限制性的NK细胞，其共同特征为表达T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)。TIL来自肿瘤组织区域，可特异识别自体肿瘤，具有特异的MHC限制性溶解肿瘤活性。美国NCI的Rosenberg等首次证实，从实体瘤组织分离的TIL在体外经IL-2激活并大量扩增后，可用于晚期黑色素瘤患者的治疗，其治疗效果远远高于之前发展的LAK(lymphokineactivatedkillercells)细胞治疗技术(文献：Expansionofhumantumorinfiltratinglymphocytesforuseinimmunotherapytrials.JImmunolMethods1987)。近年发表的多篇临床试验报道显示，TIL细胞免疫治疗可治愈20％～40％晚期黑色素瘤，充分显示出TIL作为细胞免疫治疗手段在肿瘤治疗中的潜力(文献：Anewapproachtotheadoptiveimmunotherapyofcancerwithtumorinfiltratinglymphocytes.Science1986)。然而，目前的肿瘤浸润淋巴细胞的体外扩增步骤繁琐、耗时，增殖效果并不理想，不能在短时间内有效获得可供临床治疗使用的淋巴细胞。
技术实现思路
本申请是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识作出的：专利技术人发现，在卵巢癌患者腹水中浸润有大量的肿瘤相关免疫细胞(TALs)。专利技术人通过分离卵巢癌患者腹水中的免疫细胞，优化免疫细胞的体外扩增方法，成功实现了在短时间内获得大量的可供临床使用的具有免疫杀伤效果的免疫细胞。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种培养基，所述培养基用于体外扩增恶性肿瘤腹水来源的免疫细胞。根据本专利技术的实施例，所述培养基包括：基础培养基以及促增殖因子，所述基础培养基为RPMI-1640，所述促增殖因子由重组人IL-2以及Dynabeads人T细胞激活因子CD3/CD28组成。专利技术人发现，在腹水免疫细胞的体外增殖过程中，重组人IL-2(rhIL-2)联合rhIL-10，rhIL-15或是rhIL-21，相比于rhIL-2单独使用，增殖速率反而减缓，即单独使用rhIL-2比联合其他的细胞因子在促进腹水免疫细胞的体外增殖方面具有显著优势。根据本专利技术实施例的培养基用于腹水来源的免疫细胞的体外扩增，可短时间内大量获得具有免疫杀伤效果的免疫细胞。根据本专利技术的实施例，上述培养基还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述重组人IL-2在所述培养基中的浓度为45～55U/mL，优选50U/mL。专利技术人发现，重组人IL-2在所述培养基中的浓度在上述范围内，其对腹水来源的免疫细胞的体外扩增的促进效果更加有效。根据本专利技术的实施例，所述Dynabeads人T细胞激活因子CD3/CD28(DynabeadsHumanT-activatorCD3/CD28)在所述培养基中的浓度为20～30μL/mL，优选25μL/mL。专利技术人发现，DynabeadsHumanT-activatorCD3/CD28浓度过高，反而会抑制免疫细胞的增殖，DynabeadsHumanT-activatorCD3/CD28在培养基中的浓度为20～30μL/mL，可进一步促进腹水来源的免疫细胞的体外扩增效率。根据本专利技术的实施例，所述基础培养基进一步包括Hepes，青霉素链霉素，L-谷氨酰胺，非必需氨基酸，丙酮酸钠，人AB血清(humanABserum)。根据本专利技术的实施例，所述Hepes在所述培养基中的体积分数为2.5％，所述青霉素链霉素在所述培养基中的体积分数为1％，所述L-谷氨酰胺在所述培养基中的体积分数为1％，所述非必需氨基酸在所述培养基中的体积分数为1％，所述丙酮酸钠在所述培养基中的体积分数为1％，所述人AB血清在所述培养基中的体积分数为10％。根据本专利技术的实施例，所述培养基中进一步包括恶性肿瘤患者自体腹水上清，任选地，所述自体腹水上清在所述培养基中的浓度为45～55μL/mL，优选50μL/mL。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种免疫细胞的体外扩增方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括将待扩增免疫细胞在培养基中进行扩增培养，所述待扩增免疫细胞来源于恶性肿瘤腹水，所述培养基如前面所限定的。根据本专利技术实施例的方法相比于现有的肿瘤浸润淋巴细胞的体外扩增方法，更简单有效，免疫细胞扩增时间短，仅需2-3周，增殖倍数高，扩增后可达到原始待扩增免疫细胞的1000倍，扩增后获得的淋巴细胞高度活化，特异性强，具有高效地杀伤自体肿瘤细胞的特性。根据本专利技术的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述待扩增免疫细胞在培养基中的初始浓度为0.8～1.2×106/mL，优选1×106/mL。根据本专利技术的实施例，扩增培养过程中，免疫细胞在所述培养基中的浓度为1～3×106/mL。根据本专利技术的实施例，所述待扩增免疫细胞为除去了肿瘤细胞的髓系单核细胞和淋巴细胞的混合细胞。根据本专利技术实施例的待扩增免疫细胞可直接购买获得，也可通过如下的方式分离获得。根据本专利技术的实施例，所述待扩增免疫细胞是通过如下方式获得的：1)无菌条件下收集恶性肿瘤患者引流的腹水，所述腹水不进行抗凝处理，任选地，所述腹水保存在4℃的条件下；2)将步骤1)获得的腹水进行离心处理，任选地，所述离心是在转速为1500rpm的条件下进行5min，以便获得细胞沉淀和腹水上清，任选地，所述腹水上清保存在4℃的条件下；3)将步骤2)所获得的细胞沉淀进行第一重悬处理，所述第一重悬处理是在PRMI-1640培养基中进行的；4)将步骤3)所获得的细胞悬液与淋巴细胞分离液按照体积比为2：1的比例进行混合处理，并将混合液进行密度梯度离心，以便获得细胞悬液和淋巴细胞分离液界面层细胞；5)将步骤4)所获得的界面层细胞进行漂洗处理和离心处理；6)将步骤5)所获得的细胞沉淀进行第二重悬处理，所述第二重悬处理是在PRMI-1640完全培养基中进行的，所述PRMI-1640完全培养基包括：RPMI-1640，体积分数为2.5％的Hepes，体积分数为1％的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种培养基，所述培养基用于体外扩增恶性肿瘤腹水来源的免疫细胞，其特征在于，包括：基础培养基以及促增殖因子，所述基础培养基为RPMI-1640，所述促增殖因子由重组人IL-2以及Dynabeads人T细胞激活因子CD3/CD28组成。/n
【技术特征摘要】
1.一种培养基，所述培养基用于体外扩增恶性肿瘤腹水来源的免疫细胞，其特征在于，包括：基础培养基以及促增殖因子，所述基础培养基为RPMI-1640，所述促增殖因子由重组人IL-2以及Dynabeads人T细胞激活因子CD3/CD28组成。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述重组人IL-2在所述培养基中的浓度为45～55U/mL，优选50U/mL。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述Dynabeads人T细胞激活因子CD3/CD28在所述培养基中的浓度为20～30μL/mL，优选25μL/mL。
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基进一步包括Hepes，青霉素链霉素，L-谷氨酰胺，非必需氨基酸，丙酮酸钠，人AB血清。
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述Hepes在所述培养基中的体积分数为2.5％，所述青霉素链霉素在所述培养基中的体积分数为1％，所述L-谷氨酰胺在所述培养基中的体积分数为1％，所述非必需氨基酸在所述培养基中的体积分数为1％，所述丙酮酸钠在所述培养基中的体积分数为1％，所述人AB血清在所述培养基中的体积分数为10％。
6.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基中进一步包括恶性肿瘤患者自体腹水上清，任选地，所述自体腹水上清在所述培养基中的浓度为45～55μL/mL，优选50μL/mL。
7.一种免疫细胞的体外扩增方法，其特征在于，将待扩增免疫细胞在培养基中进行扩增培养，所述待扩增免疫细胞来源于恶性肿瘤腹水，所述培养基如权利要求1～6任一项所限定的。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述待扩增免疫细胞在培养基中的初始浓度为0.8～1.2×106/mL，优选1×106/mL。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，扩增培养过程中，免疫细胞在所述培养基中的浓度...
【专利技术属性】
技术研发人员：董晨，倪凌，金莉萍，蔡东莉，
申请(专利权)人：清华大学，上海市第一妇婴保健院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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