一种泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的复合物制造技术

一种泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的复合物，涉及基因治疗领域，其包括泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质。所述复合物由

【技术实现步骤摘要】
一种泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的复合物
本专利技术涉及基因治疗领域，具体涉及一种用于核酸递送的泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的复合物纳米粒，以及制备这种复合物纳米粒的方法，及其用于体内外细胞基因转染的用途，及其在疫苗新药领域的应用。
技术介绍
基因治疗是指将外源治疗性基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。基因递送是通过递送技术将有生物活性的外源治疗性基因递送至病人的受体细胞中，并使外源治疗性基因翻译产生蛋白多肽从而治疗某种疾病。基因转染是一种将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能的技术。疫苗一般分为两类：预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗主要用于疾病的预防，接受者为健康个体或新生儿；治疗性疫苗主要用于患病的个体，接受者为患者，如肿瘤患者。预防性疫苗是将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用转基因等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后，免疫系统便会产生一定的保护物质，如免疫激素、活性生理物质、特殊抗体等；当动物再次接触到这种病原菌时，动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。肿瘤疫苗属于治疗性疫苗，其工作原理是将肿瘤细胞、肿瘤相关蛋白或多肽、表达肿瘤抗原的基因等，导入患者体内，克服肿瘤引起的免疫抑制状态，增强免疫原性，激活患者自身的免疫系统，诱导机体细胞免疫和体液免疫应答，从而达到控制或清除肿瘤的目的。mRNA疫苗是近几年发展起来的新型疫苗，是继减毒疫苗、基因工程疫苗、DNA疫苗之后的第5代新型疫苗，安全性比DNA疫苗更具优势。mRNA疫苗作为一种新的应对方案，是将编码抗原蛋白的mRNA直接导入细胞，通过细胞的表达系统合成蛋白,从而诱导特异免疫应答，与传统的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗(含多肽疫苗)、载体疫苗、DNA疫苗相比有明显的优势。首先，mRNA可被正常的细胞过程降解，降低代谢毒性的风险，体内半衰期可以通过某些修饰和递送方式进行调节，因此mRNA在体内会经历一个自然的降解过程；其次，mRNA易于合成，可编码任何新抗原，mRNA疫苗可以快速制备；另外，mRNA水溶性较好，更易成药，通过搭载各种修饰和递送方式，可有效提高mRNA疫苗稳定性，避免其在进入细胞前被体内RNA酶所降解；mRNA进入胞内后通过蛋白质翻译由机体自体产生足够的新抗原以快速启动局部T细胞，mRNA疫苗能够有效诱导B细胞和T细胞免疫应答，能引起免疫记忆效果，可以传递更多有效抗原。免疫原性方面，mRNA疫苗可以被专门设计为编码多种肽和蛋白质结构，从而表达整个抗原，还可以设计成一次表达多个抗原或在同一个纳米制剂中包含几个甚至几十段IVTmRNA序列用于制备多价mRNA疫苗。此外mRNA疫苗是非感染性的，属于非集成平台，避免了感染和插入突变的风险，还有成本低，便于保存和运输的优点。IVTmRNA除了应用于mRNA疫苗或其他恶性肿瘤免疫疗法开发外，IVTmRNA还可以应用于罕见遗传疾病的治疗、蛋白替代或蛋白补充疗法、多功能干细胞疗法和核酸酶的基因组工程等。使用IVTmRNA作为药物无非就是将特定的遗传信息转到患者的细胞中以改变某一疾病状态。有两种方法：一种是先将IVTmRNA转移到离体的细胞中，再将这些转染细胞送回患者体内，转染细胞内的IVTmRNA将信息翻译成蛋白质在患者体内发挥作用从而产生治疗效果。这种方法一般用于基因组工程、遗传重编程、基于T细胞和树突细胞(DC)的免疫疗法以治疗癌症和感染性疾病，以及一些蛋白质替代方法。另一种方法是利用各种方式直接将IVTmRNA递送到患者体内的细胞中。这种方法主要应用于肿瘤学和传染病、过敏治疗的耐受方案和其他蛋白质替代方法。IVTmRNA发挥药效学活性的主要位置是细胞质，与在细胞核中产生并通过核输出进入细胞质的天然mRNA相反，IVTmRNA必须从细胞外空间进入细胞质。两个关键因素决定细胞质生物利用度：一种是体内普遍存在的高活性RNase使其快速降解；另一种是细胞膜，其阻碍带负电的大mRNA分子被动扩散到细胞质中。由IVTmRNA翻译得到的蛋白质产物经历翻译后修饰发挥治疗作用，这两个因素的存在可能会大大降低治疗效果，因此高效的基因递送方案尤为重要。IVTmRNA模板和蛋白质产物的半衰期是药代动力学的关键决定因素。而基因的递送一直是使基因，尤其是RNAi、DNA、mRNA等基因产业转化的难点，也是基因治疗领域的痛点。基因载体是指将外源的治疗性基因导入生物细胞内的一种工具，目前国际上具有产业转化潜力的基因载体主要是病毒载体和非病毒载体。病毒载体是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞，进行感染的一种基因递送工具，可应用于基础研究、基因疗法或疫苗，目前应用前景较好的有慢病毒、腺病毒、逆转录病毒载体和腺联病毒载体等。然而病毒载体由于其固有的理化性质和生物活性，具有较为严重的缺点，比如具有生产成本高、包载量有限、靶向性差、具有插入整合与致畸致癌致突变等，不利于开发普适性和通用性的疗法。而非病毒载体包括：直接注射法、磷酸钙共沉淀法、受体介导的基因转移、显微注射法、电穿孔法、微粒子轰击法、DEAE-葡聚糖和polybrene聚阳离子法、精子载体法等。然而上述非病毒基因递送方法存在以下方面的问题：转染效率低、毒性大、操作复杂、不利于靶向修饰等。纳米粒法是指通过纳米技术在体内或体外将外源性基因运载进入细胞的一种方法，属于非病毒载体的一种。纳米粒法包括：脂质体纳米粒、胶束纳米粒、纳米微球、纳米乳、树状大分子、共聚物纳米粒、复合物纳米粒等。与其他基因递送方法比较，具有生产成本低、化学结构明确、便于质量控制、可通过靶向性修饰实现局部靶向给药、理论上包载量不受限制、无整合诱导突变的风险、可通过机体生物降解、细胞毒性小、生物相容性好、无免疫原性以及可应用于体内外的基因递送。虽然大多数细胞可以自发地摄取mRNA，但是效率很低并且在低剂量就饱和了。因此需要合适的制剂来保护IVTmRNA免受细胞外RNase介导的降解并促进其进入细胞。在病毒mRNA疫苗与肿瘤mRNA疫苗开发过程中，将特定序列的IVTmRNA递送至树突状细胞使其安全、高效、足量的表达对疫苗产生药效至关重要。目前纳米递送技术已经成为国际上在RNAi、DNA、mRNA等基因领域的主流递送技术，经过肌内、皮内、结内、皮下、静脉、鞘内、呼吸道及消化道等给药途径，使具有生物活性的基因递送至病人的受体细胞中发挥作用。这种纳米载体是未来基因体内外给药不可替代的传递系统，在临床应用上具有无限潜力。目前全球科学家已经开发了多种纳米递送载体，用于保护RNAi、DNA、mRNA等基因免受细胞外DNA酶或RNA酶介导的降解并促进其进入细胞，同时改善RNAi、DNA、mRNA等基因制剂的药代动力学性质，但目前大部分递送系统仍然存在严重的不稳定性、半衰期短、体内毒性大、转染效率低等问题。无论是肿瘤mRNA疫苗还是病毒mRNA疫苗，首先要解决的是mRNA对DC细胞的转染问题。...

【技术保护点】
1.一种泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的复合物，其特征在于包括泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质，所述泊洛沙胺结构式如式(I)或式(II)所示：/n

【技术特征摘要】
1.一种泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的复合物，其特征在于包括泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质，所述泊洛沙胺结构式如式(I)或式(II)所示：



所述泊洛沙姆的结构式如式(III)或式(IV)所示：



所述脂质为DOTAP或DOPE，其结构式下式所示：





2.如权利要求1所述泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的复合物，所述泊洛沙姆选自17R4、P-31R1、L-121、L-31、L-64、L-81、P-10R5、L-35、L-61、P-123、F108、F127、F68、P105、P104、P-85、P103或L122中的一种或几种。


3.如权利要求1所述泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的复合物，所述泊洛沙姆选自17R4、P-31R1、L-121、L-31、L-64、L-81、P-10R5、L-35、L-61、P-123、F108、F127、F68、P105、P104、P-85、P103或L122中的一种或几种。


4.如权利要求1所述泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的复合物，所述复合物由904、L-64、304、90R4、704、17R4、P-85中的任...

【专利技术属性】
技术研发人员：张龙贵，刘晨，
申请(专利权)人：深圳厚存纳米药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44