牙鲆IL-34基因的应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是牙鲆IL‑34基因在抗细菌感染应用。牙鲆IL‑34基因在制备抗细菌感染的制剂中的应用。本发明专利技术的牙鲆IL‑34基因表达质粒注射牙鲆后能够显著提高牙鲆抵抗细菌感染的能力。

Application of il-34 gene in Paralichthys olivaceus

【技术实现步骤摘要】
牙鲆IL-34基因的应用
本专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是牙鲆IL-34基因在抗细菌感染应用。
技术介绍
IL-34是一个较新发现的白细胞介素,其与colony-stimulatingfactor-1(CSF-1)有共同的受体，即CSF-1R,但IL-34与CSF-1没有明显的序列共同性。在哺乳动物中，IL-34与CSF-1R结合后，可激活NF-κB、PI3K/AKT、JAK/STAT、MAPK、ERK1/2、JNK等通路。IL-34在包括在吞噬细胞、上皮细胞等多种细胞中表达，并且其表达受到促炎因子、微生物病原等的调控。在功能上，IL-34调控单核吞噬细胞(单核细胞、巨噬细胞以及破骨细胞等)的分化、增值以及存活，通过NF-κB信号途径调控炎症反应以及疾病等。与哺乳动物相比，鱼类IL-34研究较少，主要聚焦于IL-34基因的转录表达，功能研究很少。牙鲆IL-34研究尚无报道。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供牙鲆IL-34基因的应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种牙鲆的IL-34基因的应用，牙鲆IL-34基因用于制备抗细菌感染的制剂中的应用。所述表达牙鲆IL-34基因的质粒pCN3-IL-34在制备牙鲆抗细菌感染制剂中的应用。所述牙鲆IL-34基因的表达质粒pCN3-IL-34为以牙鲆cDNA为模板，分别用引物F1/R1进行PCR扩增，扩增产物与载体pCN3连接，即获得含IL-34基因质粒pCN3-IL-34；所述F1为5’-GATATCGCCACCATGATCCAACTGTCCACCTCA-3’；R1为5’-GATATCGCCACCGCTCTCTTCTTTCTTCCTGCCT-3’。所述细菌为迟缓爱德华氏菌。本专利技术具有如下优点：本专利技术的牙鲆IL-34基因表达质粒注射后能够促进炎症因子如IL-1beta,IL-6和IL-8的表达，并能显著提高牙鲆的抗细菌能力。附图说明图1为本专利技术实施例提供的牙鲆IL-34基因表达质粒抑制迟缓爱德华氏菌感染(**P<0.01)。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而非以任何形式对本专利技术进行限制。在本专利技术实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。2.大肠杆菌用Hanahan方法(SambrookandRussell:MolecularCloning:ALaboratoryMannual.ColdSpringHarborLaboratoryPress2001)。3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。实施例1牙鲆IL-34基因表达质粒pCN3-IL-34的构建：牙鲆IL-34基因的序列已被报道(GenBankaccessionnumber：XM_020104587.1)。pCN3-IL-34的构建如下：以牙鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增IL-34基因。PCR条件为：94℃5min预变性模板DNA,然后94℃30s,60℃30s,72℃60s,30个循环后72℃10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pEASY-Simple-T(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室温连接15-30min，连接混合液转化到大肠杆菌DH5α后在含有100μg/ml安卡青霉素(Ap)的LB固体培养基上培养18－24小时，挑出转化子，提取质粒，命名为质粒pEasyIL34。将表达载体pCN3(构建过程参见JiaoXD,ZhangM,HuYH,SunL.ConstructionandevaluationofDNAvaccinesencodingEdwardsiellatardaantigens.Vaccine2009；27:5195–202.)用限制性内切酶EcoRV酶切后回收5.4kb片段，同时将pEasyIL34用EcoRV酶切回收IL-34片段。将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接10-12小时，连接液转化入大肠杆菌DH5，在氨苄青霉素(100ug/ml)的LB培养基培养18－24小时,挑取转化子提取质粒，命名为pCN3-IL-34。通过DNA测序分析证明了pCN3-IL-34为含有IL-34基因序列的表达质粒。所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。所述F1为5’-GATATCGCCACCATGATCCAACTGTCCACCTCA-3’；R1为5’-GATATCGCCACCGCTCTCTTCTTTCTTCCTGCCT-3’。实施例2牙鲆IL-34基因表达质粒pCN3-IL-34对IL-1beta,IL-6和IL-8表达的影响步骤1)质粒注射将上述实施例1的pCN3-IL-34以及pCN3质粒分别经PBS稀释至300ug/ml，即为pCN3-IL-34稀释液和pCN3稀释液。将15条牙鲆(重约21g)随机分为3组，每组5条。将这3组分别命名为A，B和C。将A组的每条鱼分别注射50ulpCN3-IL-34稀释液，将B组的每条鱼分别注射50ulpCN3稀释液，将C组(对照组)的每条鱼分别注射50ulPBS。所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na2HPO4.12H2O,0.024％NaH2PO4，余量为水。步骤2)基因表达检测在上述步骤1)注射后第5天，自A,B和C三组中分别取出5条鱼，取其头肾和脾脏组织，提取RNA并反转成cDNA用于qRT-PCR(具体方法参见ZhangBC,ZhangJ,SunL.In-depthprofilingandanalysisofhostandviralmicroRNAsinJapaneseflounder(Paralichthysolivaceus)infectedwithmegalocytivirusrevealinvolvementofmicroRNAsinhost-virusinteractioninteleostfish.BMCGenomics.2014；15:878)，检测IL-1beta,IL-6和IL-8表达。结果表明，A组鱼头肾和脾脏的IL-1beta,IL-6和IL-8的表达量显著(P<0.05)高于C组鱼，但B组鱼头肾和脾脏的IL-1beta,IL-6和IL-8的表达量与C组无显著差异。这些结果表明，含有IL-34基因的质粒pCN3-IL-34能够显著增强牙鲆IL-1beta,IL-6和IL-8的表达。实施例3牙鲆IL-34基因表达质粒pCN3-IL-34的应用步骤1)质粒注射将上述实施例1的pCN3-IL-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牙鲆基因的应用，其特征在于：牙鲆IL-34基因在制备抗细菌感染的制剂中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.一种牙鲆基因的应用，其特征在于：牙鲆IL-34基因在制备抗细菌感染的制剂中的应用。


2.按权利要求1所述的牙鲆基因的应用，其特征在于：所述牙鲆IL-34基因的表达质粒pCN3-IL-34在制备抗细菌感染制剂中的应用。


3.按权利要求2所述的牙基因的应用，其特征在于：所述牙鲆IL-34基因的表达质粒pCN3-IL-34为以牙鲆cDNA为模板，分别用...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙黎，于超，管晓璐，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37