用于脂肪营养不良的自体细胞疗法的人脂肪组织祖细胞制造技术

用于治疗脂肪营养不良的人脂肪干细胞、其富集群以及由其衍生的白色脂肪细胞的制备方法。

Human adipose tissue progenitor cells for autogenous cell therapy of lipodystrophy

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于脂肪营养不良的自体细胞疗法的人脂肪组织祖细胞优先权要求本申请要求于2017年8月10日提交的美国申请第62/543,597号的权益。前述申请的全部内容通过引用在此并入。联邦赞助的研究或开发本专利技术是在美国国立卫生院(NationalInstitutesofHealth)授予的资助号DK089101的支持下完成的。政府拥有本申请的某些权利。
本专利技术涉及使用能够产生脂肪细胞的人祖细胞及其富集群的制剂治疗脂肪营养不良的方法。
技术介绍
自体细胞疗法包括：提取个体的自身细胞，在体外对其进行基因或化学修饰，将其扩增为大量细胞，并且将其再引入个体中以用于治疗目的。自体细胞疗法的最佳形式是CAR-T疗法，其中提取个体的免疫细胞，进行基因修饰以使其能够攻击癌细胞，并将其再引入到患者中。近来，该疗法已被推荐获得FDA批准。然而，自体细胞疗法不限于免疫细胞，而且还可以考虑使用组织祖细胞来再生和修复组织。自体细胞疗法的一项独有的优点是其不受移植排异和移植物抗宿主疾病问题的困扰，因此避免了毒性免疫抑制疗法。
技术实现思路
脂肪营养不良是个体完全缺乏皮肤脂肪组织(皮下脂肪组织)或皮下脂肪组织不足的疾病(RobbinsandSavage2015,HussainandGarg2016)。其严重程度和发作年龄不等，从缺乏可见脂肪的儿童(先天性全身性脂肪营养不良)到在一段年龄内手臂和腿部脂肪流失的年轻成年人(家族性部分性脂肪营养不良)。患有脂肪营养不良的个体会发展出非常严重的代谢病，特征在于高脂血症、2型糖尿病、高胰岛素血症、肝脂肪变性和动脉粥样硬化。患有脂肪营养不良的患者在儿童期或成年早期就会死于代谢病。在本文中描述了在不使用或使用基因操纵在体外诱导人脂肪形成的情况下使用人祖细胞作为用于人脂肪营养不良的自体治疗剂的用途。因此，本文提供了用于提供用于治疗患有与基因突变相关的脂肪营养不良的患者的脂肪祖细胞群的方法。所述方法包括：从患有与基因突变相关的脂肪营养不良的受试者获得包含第一脂肪细胞群的原代脂肪组织，和(i)在蛋白质-凝胶基质中在促血管生成因子存在下培养原代脂肪组织以诱导第二细胞群的生长；(ii)从第二群分离细胞以形成包含脂肪祖细胞的富集群的第三细胞群；和在足以使细胞分化的条件下将脂肪祖细胞群保持足以使细胞分化的时间，从而提供用于治疗患有与基因突变相关的脂肪营养不良的患者的脂肪祖细胞群。在一些实施方式中，第二细胞群经过酶消化，例如，使用分散酶，以产生第三细胞群。在一些实施方式中，所述方法还包括将基因修饰的脂肪祖细胞与可注射水凝胶混合。在一些实施方式中，从第二分离细胞群包括从第二群分离CD45-CD29+CD34+CD24+CD144-细胞。本文还提供了通过本文所述方法制备的分离富集的脂肪族细胞群。在一些实施方式中，分离的脂肪祖细胞的富集群是在可注射水凝胶中。在一些实施方式中，所述方法包括对第二细胞群或第三细胞群进行基因修饰以纠正基因突变，从而提供基因修饰的脂肪祖细胞群。本文还提供了通过本文所述的方法制成的例如在可注射水凝胶中的分离富集的基因修饰的脂肪祖细胞群。在一些实施方式中，所述方法包括在足以使细胞分化为白色脂肪细胞的条件下保持培养足以使细胞分化为白色脂肪细胞的时间，所述白色脂肪细胞例如表达ADIPOQ、PLIN1和/或LEP的细胞。在一些实施方式中，脂肪祖细胞可被保持在可注射水凝胶中。本文还提供了通过本文所述方法制备的分离富集的白色脂肪细胞群。此外，本文提供了用于治疗患有脂肪营养不良(例如，CGL1或CGL2)的受试者的方法。所述方法包括对受试者施用如本文所述的分离富集的脂肪祖细胞群；分离富集的基因修饰的脂肪祖细胞群；和/或分离富集的白色脂肪细胞群，例如，通过本文所述方法制成的。在一些实施方式中，细胞由从所治疗的受试者获得的第一细胞群(例如，脂肪组织)制成。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域普通技术人员通常理解的相同含义。方法和材料在本文中被描述为用于本专利技术；本领域中已知的其他合适的方法和材料也可使用。材料、方法和实例仅为说明性的，并非旨在限制。本文中提到的所有公开出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均通过引用以其整体并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。本专利技术的其他特征和邮件将从以下详细说明和附图以及权利要求而显而易见。序列表本专利技术包括序列表，其以ASCII形式电子提交，并且通过引用一起整体并入本文。所述ASCII副本创建于2017年8月9日，名为07917_0403WO1_SL.txt，并且大小为453,025字节。附图说明图1：在MatriGel中在专有培养基EGM2-MV(Lonza)中培养的人外植体的图像。祖细胞与新生的毛细血管芽一起增殖。图2A-C：在暴露于由甲基异黄嘌呤-黄嘌呤、地塞米松和胰岛素(MDI)组成的成脂混合物达7-14周之后，祖细胞分化为脂肪细胞(HACAPS)的图像。B.在成脂分化之前(MDI-)和成脂分化2周之后(MDI+)从HACAPS获得的cDNA的RT-PCR分析。注意x轴上的对数尺度用于脂肪细胞-特异性基因围脂滴蛋白-1(PLIN1)、脂连蛋白(adiponectin)(ADIPOQ)、胰岛素响应性葡萄糖转运蛋白(Glut4)和脂肪酸结合蛋白-4(FABP4)的诱导。C.当通过线粒体标记MitoTrackerRed染色评估时，在培养14周之后HACAPS仍有代谢活性。图3A-F：从HACAPS形成功能性脂肪组织。A.用于移植的细胞的相图。B.细胞悬浮在Matrigel中。C.仅用Matrigel注射的小鼠的背部区域。D.6周之后剩余的水凝胶。E.用HACAPS注射的小鼠的背部区域。F.由显示血管化的HACAPS形成的切除脂肪组织(箭头)。图4A-B：由HACAPS形成的脂肪组织是功能性和代谢活性的。A.小鼠循环中的人脂连蛋白水平与由HACAPS形成的脂肪组织的大小成正比，证明了功能整合。B.小鼠循环中全身葡萄糖周转随着人脂连蛋白的增加而增加，这反应了由HACAPS形成的脂肪组织是代谢活性的。图5：通过分泌到培养基中的ADIPOQ评估的HACAPS的功能性质。细胞浓度以及叠氮化物-和DBCO-末端的结构单元的变化均会导致用于脂肪组织形成的理想水凝胶配方。在第一个实验中，细胞数从10,000变化到1,000,000以测定在[酰胺-DBCO]:[CH2-N3]＝1:1的网络上的ADIPOQ产生的线性范围。随后，以三种[酰胺-DBCO]:[CH2-N3]比率(0.6:1.0,1:1和1:0.6)在2.5％和5％的凝胶刚性范围内检测细胞的固定数(250,000)。0.6:1的比率有明显优势，在2.5和5％凝胶之间的差异较小。图6：用于从来源于组织的祖细胞产生人脂肪细胞的示例性方法。详细描述在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提供脂肪祖细胞群的方法，所述脂肪祖细胞群用于治疗患有与基因突变相关的脂肪营养不良的受试者，所述方法包括：/n从患有与基因突变相关的脂肪营养不良的受试者获得包含第一脂肪细胞群的原代脂肪组织，和/n(i)在蛋白质-凝胶基质中在促血管生成因子存在下培养原代脂肪组织以诱导第二细胞群的生长；/n(ii)从所述第二群分离细胞以形成包含富集脂肪祖细胞群的第三细胞群；和/n在足以使细胞增殖的条件下将所述脂肪祖细胞群保持足以使细胞增殖的时间，/n从而提供用于治疗患有与基因突变相关的脂肪营养不良的患者的脂肪祖细胞群。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170810 US 62/543,5971.一种提供脂肪祖细胞群的方法，所述脂肪祖细胞群用于治疗患有与基因突变相关的脂肪营养不良的受试者，所述方法包括：
从患有与基因突变相关的脂肪营养不良的受试者获得包含第一脂肪细胞群的原代脂肪组织，和
(i)在蛋白质-凝胶基质中在促血管生成因子存在下培养原代脂肪组织以诱导第二细胞群的生长；
(ii)从所述第二群分离细胞以形成包含富集脂肪祖细胞群的第三细胞群；和
在足以使细胞增殖的条件下将所述脂肪祖细胞群保持足以使细胞增殖的时间，
从而提供用于治疗患有与基因突变相关的脂肪营养不良的患者的脂肪祖细胞群。


2.权利要求1所述的方法，其中所述第二细胞群进行酶消化以产生所述第三细胞群。


3.权利要求2所述的方法，其中所述第二细胞群进行分散酶消化。


4.权利要求1所述的方法，还包括将基因修饰的脂肪祖细胞与可注射水凝胶混合。


5.权利要求1所述的方法，其中从所述第二群分离细胞包括从所述第二群中分离CD45-CD29+CD34+CD24+CD144-细胞。


6.一种分离富集的脂肪祖细胞群，其通过权利要求1-5所述的方法制备。


7.权利要求6所述的分离富集的脂肪祖细胞群，其在可注射水凝胶中。


8.权利要求1所述的方法，还包括对所述第二细胞群或所述第三细胞群进行基因修饰以纠正基因突变，从而提供基因修饰的脂肪祖细胞群。


9....

【专利技术属性】
技术研发人员：S科尔韦拉，
申请(专利权)人：马萨诸塞大学，
类型：发明
国别省市：美国;US