一种能有效抑制褐变产生的山葵花苔愈伤组织的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种能有效抑制褐变产生的山葵花苔愈伤组织的培养方法，该方法针对山葵花苔外植体在愈伤组织诱导和大量增殖培养过程中常出现严重褐变从而造成培养物大量死亡的情况，创新性地使用含头孢哌酮舒巴坦钠的无菌水冲洗消毒后的材料，并对愈伤组织诱导和增殖培养基的组成成分进行改良，同时在山葵愈伤组织增殖培养前增加了用含头孢噻肟钠的水溶液进行预处理的步骤。本发明专利技术有效地解决了山葵花苔外植体在其愈伤组织诱导和增殖培养过程中易产生褐变的问题，为山葵植物有效成分的生产提供了一条新的途径；同时本发明专利技术还对于更深入地开展山葵植物的生物技术研究奠定了一定的理论基础。

A culture method of sunflower moss callus which can effectively inhibit Browning

【技术实现步骤摘要】
一种能有效抑制褐变产生的山葵花苔愈伤组织的培养方法
本专利技术涉及一种山葵花苔愈伤组织的培养方法，特别是涉及一种能有效抑制褐变产生的山葵花苔愈伤组织的培养方法。
技术介绍
山葵(WasabijaponicaMatsum)又名山嵛菜、山菜，为十字花科山嵛菜属多年生半阴生草本植物。山葵全株植物中含有一种芥子苷类的物质，在植物细胞被磨碎时,该物质在芥子苷酶的作用下水解形成异硫氰酸酯类化合物，具有杀菌、防腐、利尿、清血、抗感染、抗癌等多种药用活性，该产品受到越来越多人的青睐，是国际上公认的极为稀缺和珍贵的药食同源植物，被称为“绿色黄金”。然而由于山葵植物的生长发育对环境要求极为苛刻,仅适于在海拔高度为1000～2000米的高山地区种植，生育温度为8～22℃，最适温度为12～15℃，超过23℃即不适宜栽培，温度在23-30℃易发生软腐病；低于-3℃时又易受冻害；因此，山葵资源十分稀少，目前完全不能满足市场的需求。而开展山葵的生物技术研究，通过组织培养方式大量生产异硫氰酸酯类化合物含量高的山葵愈伤组织，是获得山葵植物中有效成分的有效途径。目前已有学者对山葵植物多个不同部位器官进行了愈伤组织诱导方面的研究，但选择其生物产量和有效成分含量都较高的山葵植物花苔作为外植体进行愈伤组织诱导和增殖培养的研究还几乎未见报道。由于山葵花苔细胞中含有较多的异硫氰酯酸类化合物和其它一些易氧化物质，使得在其愈伤组织诱导和大量增殖培养过程中常出现严重的褐变而造成培养材料的大量死亡，这也是当前利用生物技术大规模生产山葵有效成分的一大难题。目前还未见有相关解决方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能有效抑制褐变产生的山葵花苔愈伤组织的培养方法，该方法能有效抑制山葵花苔愈伤组织在诱导和增殖培养中易产生褐变的问题。为达到上述目的，本专利技术采用的解决方案包括如下步骤：(1)外植体的选取和消毒：选取山葵花苔顶芽下10～20cm长度的花苔作为外植体，将其消毒后用无菌滤纸吸干表面的水分；(2)愈伤组织诱导培养：将消毒后的山葵花苔切成1～2cm的长度，然后迅速接入改良MS+6-BA0.5～1.5mg/L+2,4-D2.0～4.0mg/L+酪氨酸50～100g/L+葡萄糖10～20g/L+山梨糖5～15g/L+琼脂4.5～5.5g/L的愈伤组织诱导培养基中，在培养温度为18～22℃、每天光照4～8h和光照强度为300～500lx的条件下进行培养，所述改良MS基本培养基的铁盐改为55.6mg/L、KNO3改为316～950mg/L；(3)愈伤组织增殖预培养：选取颜色为绿色的愈伤组织，放入浓度为50～100mg/L的头孢噻肟钠无菌水中，在摇床转速为100～200r/min、无光照条件下预培养12～24小时；(4)愈伤组织增殖培养：将预培养后的愈伤组织接入White+6-BA1.0～2.0mg/L+2,4-D1～3mg/L+NAA0.5～1mg/L+植酸2.0～6.0ml/L+蔗糖10～20g/L+EDTA10～20g/L+琼脂4.0～6.0g/L的愈伤组织增殖培养基中，在培养温度14～18℃、每天光照4～6h和光照强度为600～800lx的条件下进行增殖培养；上述所有培养基的pH值均为5.5。进一步地，步骤(1)中所述消毒是指先用浓度为0.1％的升汞消毒4～8min，再用浓度为40～80mg/L的头孢哌酮舒巴坦钠无菌水冲洗3～6次。本专利技术有效地解决了山葵花苔外植体在其愈伤组织诱导和增殖培养过程中易产生褐变的问题，为山葵植物有效成分的生产提供了一条新的途径。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细说明。实施例1本实施例提供的一种能有效抑制褐变产生的山葵花苔愈伤组织的培养方法包括如下步骤：(1)外植体的选取和消毒：选取山葵花苔顶芽下15cm长度的花苔作为外植体，将其放在超净工作台上，先用浓度为0.1％的升汞消毒6min，再用浓度为60mg/L的头孢哌酮舒巴坦钠无菌水冲洗5次，然后用无菌滤纸吸干表面的水分；(2)愈伤组织诱导培养：将消毒后的山葵花苔切成1.5cm的长度，然后迅速接入改良MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D3.0mg/L+酪氨酸75g/L+葡萄糖15g/L+山梨糖10g/L+琼脂5.0g/L的愈伤组织诱导培养基中，在培养温度为20℃、每天光照6h和光照强度为400lx的条件下进行培养，所述改良MS基本培养基的铁盐改为55.6mg/L、KNO3改为633mg/L；培养30天统计其愈伤组织的诱导率为87.74％，愈伤组织的褐化率为0％；(3)愈伤组织增殖预培养：选取颜色为绿色的愈伤组织，放入浓度为80mg/L的头孢噻肟钠无菌水中，在摇床转速为150r/min、无光照条件下预培养18小时；(4)愈伤组织增殖培养：将增殖预培养后的愈伤组织接入White+6-BA1.5mg/L+2,4-D2.0mg/L+NAA0.75mg/L+植酸4.0ml/L+蔗糖15g/L+EDTA15g/L+琼脂5.0g/L的愈伤组织增殖培养基中，在培养温度16℃、每天光照5h和光照强度为700lx的条件下进行增殖培养，培养30天统计其愈伤组织的增殖倍数为2.89倍，增殖愈伤组织的褐化率为0％；上述所有培养基的pH值均为5.5。实施例2本实施例提供的一种能有效抑制褐变产生的山葵花苔愈伤组织的培养方法包括如下步骤：(1)外植体的选取和消毒：选取山葵花苔顶芽下10cm长度的花苔作为外植体，将其放在超净工作台上，先用浓度为0.1％的升汞消毒4min，再用浓度为40mg/L的头孢哌酮舒巴坦钠无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸吸干表面的水分；(2)愈伤组织诱导培养：将消毒后的山葵花苔切成1cm的长度，然后迅速接入改良MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D2.0mg/L+酪氨酸50g/L+葡萄糖10g/L+山梨糖5g/L+琼脂4.5g/L的愈伤组织诱导培养基中，在培养温度为18℃、每天光照4h和光照强度为300lx的条件下进行培养，所述改良MS基本培养基的铁盐改为55.6mg/L、KNO3改为316mg/L；培养30天统计其愈伤组织的诱导率为79.84％，愈伤组织的褐化率为7.80％；(3)愈伤组织增殖预培养：选取颜色为绿色的愈伤组织，放入浓度为50mg/L的头孢噻肟钠无菌水中，在摇床转速为100r/min、无光照条件下预培养12小时；(4)愈伤组织增殖培养：将增殖预培养后的愈伤组织接入White+6-BA1.0mg/L+2,4-D1.0mg/L+NAA0.5mg/L+植酸2.0ml/L+蔗糖10g/L+EDTA10g/L+琼脂4.0g/L的愈伤组织增殖培养基中，在培养温度14℃、每天光照4h和光照强度为600lx的条件下进行增殖培养，培养30天统计其愈伤组织的增殖倍数为2.34倍，增殖愈伤组织的褐化率为4.79％；上述所有培养基的pH值均为5.5。实施例3本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能有效抑制褐变产生的山葵花苔愈伤组织的培养方法，其特征在于包括如下步骤：/n(1)外植体的选取和消毒：选取山葵花苔顶芽下10～20cm长度的花苔作为外植体，将其消毒后用无菌滤纸吸干表面的水分；/n(2)愈伤组织诱导培养：将消毒后的山葵花苔切成1～2cm的长度，然后迅速接入改良MS+6-BA0.5～1.5mg/L+2,4-D2.0～4.0mg/L+酪氨酸50～100g/L+葡萄糖10～20g/L+山梨糖5～15g/L+琼脂4.5～5.5g/L的愈伤组织诱导培养基中，在培养温度为18～22℃、每天光照4～8h和光照强度为300～500lx的条件下进行培养，所述改良MS基本培养基的铁盐改为55.6mg/L、KNO

【技术特征摘要】
1.一种能有效抑制褐变产生的山葵花苔愈伤组织的培养方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)外植体的选取和消毒：选取山葵花苔顶芽下10～20cm长度的花苔作为外植体，将其消毒后用无菌滤纸吸干表面的水分；
(2)愈伤组织诱导培养：将消毒后的山葵花苔切成1～2cm的长度，然后迅速接入改良MS+6-BA0.5～1.5mg/L+2,4-D2.0～4.0mg/L+酪氨酸50～100g/L+葡萄糖10～20g/L+山梨糖5～15g/L+琼脂4.5～5.5g/L的愈伤组织诱导培养基中，在培养温度为18～22℃、每天光照4～8h和光照强度为300～500lx的条件下进行培养，所述改良MS基本培养基的铁盐改为55.6mg/L、KNO3改为316～950mg/L；
(3)愈伤组织增殖预培养：选取颜色为绿色的愈伤组织，放入浓度为50～100mg/L的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王跃华，吴桐宇，吴嘉琪，陈芳，马涛，刘真珍，刘崧任，魏博坤，何佳懋，许班，高健，
申请(专利权)人：成都大学，
类型：发明
国别省市：四川;51