本发明专利技术公开了一种快速的沙漠蔷薇愈伤组织诱导和规模化悬浮培养方法。通过对培养基中基础元素和激素进行大量筛选比较和其它实验条件摸索，建立了一种沙漠蔷薇的无菌苗培养和愈伤诱导方法，以沙漠蔷薇成熟种子为外植体，迅速萌发获得无菌苗，以沙漠蔷薇无菌苗的茎、叶片、根为外植体，在2周内快速获得愈伤组织，并建立了沙漠蔷薇愈伤组织继代培养方案，按此方法可以得到生长迅速、分散良好的沙漠蔷薇悬浮细胞系，接入一次性生物反应器进行逐级放大培养。有效的解决了解决沙漠蔷薇细胞产量不足的问题。
A rapid method of callus induction and large-scale suspension culture of Rosa Deserta
【技术实现步骤摘要】
一种快速的沙漠蔷薇愈伤组织诱导和规模化悬浮培养方法
本专利技术属于植物组织培养
，涉及一种快速的沙漠蔷薇愈伤组织诱导和规模化悬浮培养方法。
技术介绍
沙漠蔷薇（Adeniumobesum.），又名沙漠玫瑰，天宝花，是夹竹桃科沙漠玫瑰属多年生肉质植物。原产自非洲的科尼亚、坦桑尼亚、索马里及津巴布韦，因原产地接近沙漠且花红如玫瑰而得名。沙漠蔷薇喜高温干燥和阳光充足的环境，耐酷暑，不耐寒，忌水湿。喜富含钙质的、疏松透气的、排水良好的砂质壤土。沙漠玫瑰单叶互生，倒卵形，革质，有光泽；总状花序，个儿大、量多，花色丰富、艳丽，花期且长。有研究表明沙漠蔷薇提取物有很好的药用价值和美容功效。沙漠蔷薇中可提取出30种强心苷和两种孕烷，可用于治疗心脏病和妇科病；沙漠蔷薇叶提取物中的活性成分具有保湿润肤，抗衰老等美容功效，花朵内含高浓度海藻糖，有减少晒黑和皮肤老化、有效保护细胞膜和肌肤的储水功能。沙漠蔷薇自花结实率低，不容易长果荚，种子少，不易收集；且人工授粉较难，操作成功率低，一般是用半成熟枝扦插来来栽培，但繁殖速度慢。植物组织培养技术，具体涉及沙漠蔷薇，以无菌苗的茎、叶片、根等作为外植体诱导细胞脱分化形成愈伤组织，愈伤组织的固体继代及液体悬浮培养基方法，高效培养沙漠蔷薇细胞。目前国内尚无沙漠蔷薇植物组织培养方面的专利，几乎没有沙漠蔷薇愈伤组织诱导和规模化悬浮培养方面的文献报道。沙漠蔷薇的组织培养体系尚不成熟，该物种在常规植物培养条件下不能存活。
技术实现思路
本专利旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种快速获得沙漠蔷薇无菌苗、愈伤组织并进行规模化的方法，解决沙漠蔷薇细胞产量不足的问题。为实现上述目的，本专利技术干红开了如下的
技术实现思路
：一种快速的沙漠蔷薇愈伤组织诱导和规模化悬浮培养方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）沙漠蔷薇种子消毒：将沙漠蔷薇种子用常温水浸泡10-15min，剥除软质种皮，立刻置入4%次氯酸钠溶液消毒8-10min，无菌水洗涤4次，置于种子萌发基础培养基BM上，27-29℃培养，光照强度＜1000lux；种子萌发培养基BM指的是：1/2MS或MS+30g/L蔗糖+0.1mg/LGln+0.2mg/L水解乳蛋白，琼脂0.7-1.0%，pH5.8-6.0；（2）沙漠蔷薇无菌苗培养：将已萌发的沙漠蔷薇无菌苗种子在基础培养基BM中培养至植株高2-3cm，开始快繁，快繁方式为将沙漠蔷薇无菌苗去除根部，移入快繁培养基PM，需要7-14d发生侧芽，待侧芽生长至1.5-2cm切下用于再次快繁或生根，培养过程温度控制在25℃-32℃，光照强度500-1500lux；所述的快繁培养基PM指的是：MS+0.1-0.5mg/LIAA（吲哚乙酸）+0.2-0.5mg/L6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）+30g/L蔗糖+0.1mg/LGln（谷氨酰胺）+0.2mg/L水解乳蛋白，琼脂0.7-1.0%，pH5.8-6.0；（3）沙漠蔷薇愈伤组织诱导：将沙漠蔷薇的叶片（或茎、根）剪成0.5-1cm长的小段，置于愈伤诱导培养基CIM，26-32℃培养，光照强度＜1000lux，7-14d即在切口边缘形成白色疏松的愈伤组织；所述的愈伤诱导培养基CIM指的是B5植物组织培养基+1-2mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+0.1mg/LGln（谷氨酰胺）+0.2mg/L水解乳蛋白，琼脂0.7-1.0%，pH5.8-6.0；（4）沙漠蔷薇愈伤组织继代：将诱导获得的沙漠蔷薇愈伤组织分成约0.5cm大小的小块，置于愈伤继代培养基CM1，26-32℃培养，光照强度＜1000lux，每7-10d继代一次；所述的愈伤继代培养基CM1指的是：B5+0.5-1mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+0.1mg/LGln+0.2mg/L水解乳蛋白，琼脂0.7-1.0%，pH5.8-6.0；（5）沙漠蔷薇愈伤组织悬浮培养：选取质地疏松、颜色白色至浅黄色、生长速度快的沙漠蔷薇愈伤组织，按1g/10mL比例接入悬浮培养基CM2，置于摇床100-115rpm培养，温度保持26-32℃，按5-15g/100mL比例（湿重）每7-10d继代一次，生长速度3-4倍/7d；所述的悬浮培养基CM2指的是：B5+0.5-1mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+0.1mg/LGln+0.2mg/L水解乳蛋白，pH5.8-6.0；（6）沙漠蔷薇愈伤组织的一次性生物反应器培养：选取状态一致的已培养7d的悬浮培养材料，向5L一次性生物反应器中接入1000-1500mL悬浮培养物和除菌处理的3500-4000mL悬浮培养基CM2使终体积为5000mL，振频为9.5次/min，通空气为0.1m³/h，培养7d。继代时，将培养物接入新的一次性生物反应器，加入2-4倍体积的悬浮培养基CM2，振荡并通气培养，振荡频率范围为2-15次/min，通气量为0.05-0.3m³/h，培养过程中反应器的振频为5-20次/min。培养是在公开号为CN103224882A或CN204385208U的中国专利文献所披露的生物反应器中进行的，培养过程中反应器的振频为5-20次/min。本专利技术进一步公开了所述的培养方法在快速获得生长迅速、分散良好的沙漠蔷薇悬浮细胞系方面的应用。实验结果显示：以沙漠蔷薇成熟种子为外植体，可迅速萌发获取无菌苗，并在2周内获得质地疏松、生长迅速、白色至浅黄的愈伤组织，其悬浮细胞系分散良好，生长迅速，7d可生长3-4倍，并实现5-200L一次性生物反应器稳定培养。本专利技术更加详细的描述如下：本专利技术通过对培养基中基础元素和激素进行大量筛选比较和其它实验条件摸索，建立了一种沙漠蔷薇的无菌苗培养和愈伤诱导方法，以沙漠蔷薇成熟种子为外植体，迅速萌发获得无菌苗，以沙漠蔷薇无菌苗的茎、叶片、根为外植体，在2周内快速获得愈伤组织，并建立了沙漠蔷薇愈伤组织继代培养方案，按此方法可以得到生长迅速、分散良好的沙漠蔷薇悬浮细胞系，接入一次性生物反应器进行逐级放大培养。沙漠蔷薇种子消毒：将沙漠蔷薇种子用常温水浸泡10-15min，剥除软质种皮，立刻置入4%次氯酸钠溶液消毒8-10min，无菌水洗涤4次，置于基础培养基BM（1/2MS或MS+30g/L蔗糖+0.1mg/LGln+0.2mg/L水解乳蛋白，琼脂0.7-1.0%，pH5.8-6.0）上，27-29℃培养，光照强度＜1000lux。3-10天即可萌发。沙漠蔷薇无菌苗培养：将已萌发的沙漠蔷薇无菌苗种子在基础培养基BM中培养至植株高2-3cm，即可开始快繁。快繁方式为将沙漠蔷薇无菌苗去除根部，移入快繁培养基PM（MS+0.1-0.5mg/LIAA+0.2-0.5mg/L6-BA+30g/L蔗糖+0.1mg/LGln+0.2mg/L水解乳蛋白，琼脂0.7-1.0%，pH5.8-6.0），7-14d即可发生侧芽。待侧芽生长至1.5cm以上即可切下用于再次快繁或生根。培养过程温度控制在25℃-32℃，光照强度500-1500lux。沙漠蔷薇愈伤组织诱导：将沙本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种快速的沙漠蔷薇愈伤组织诱导和规模化悬浮培养方法，其特征在于按如下的步骤进行：/n（1）沙漠蔷薇种子消毒：将沙漠蔷薇种子用常温水浸泡10-15min，剥除软质种皮，立刻置入4%次氯酸钠溶液消毒8-10min，无菌水洗涤4次，置于基础培养基BM上，27-29℃培养，光照强度＜1000 lux；所述的基础培养基BM指的是：1/2MS或MS+ 30g/L蔗糖 + 0.1mg/L Gln+ 0.2mg/L 水解乳蛋白，琼脂0.7-1.0%，pH5.8-6.0；/n（2）沙漠蔷薇无菌苗培养：将已萌发的沙漠蔷薇无菌苗种子在基础培养基BM中培养至植株高2-3cm，开始快繁，快繁方式为将沙漠蔷薇无菌苗去除根部，移入快繁培养基PM，需要7-14d发生侧芽，待侧芽生长至1.5-2cm切下用于再次快繁或生根，培养过程温度控制在25℃-32℃，光照强度500-1500 lux；/n所述的快繁培养基PM指的是：MS + 0.1-0.5 mg/L IAA + 0.2-0.5 mg/L 6-BA + 30g/L蔗糖 + 0.1mg/L Gln + 0.2mg/L 水解乳蛋白，琼脂0.7-1.0%，pH5.8-6.0；/n（3）沙漠蔷薇愈伤组织诱导：将沙漠蔷薇的叶片或茎、根剪成0.5-1cm长的小段，置于愈伤诱导培养基CIM，26-32℃培养，光照强度＜1000 lux，7-14d即在切口边缘形成白色疏松的愈伤组织；所述的愈伤诱导培养基CIM指的是B5 + 1-2mg/L 2,4-D + 30g/L蔗糖 +0.1mg/L Gln + 0.2mg/L 水解乳蛋白，琼脂0.7-1.0%，pH5.8-6.0；/n（4）沙漠蔷薇愈伤组织继代：将诱导获得的沙漠蔷薇愈伤组织分成约0.5cm大小的小块，置于愈伤继代培养基CM1，26-32℃培养，光照强度＜1000 lux，每7-10d继代一次；所述的愈伤继代培养基CM1指的是：B5 + 0.5-1 mg/L 2,4-D + 30g/L蔗糖 + 0.1mg/L Gln +0.2mg/L 水解乳蛋白，琼脂0.7-1.0%，pH5.8-6.0；/n（5）沙漠蔷薇愈伤组织悬浮培养：选取质地疏松、颜色白色至浅黄色、生长速度快的沙漠蔷薇愈伤组织，按1g/10mL比例接入悬浮培养基CM2，置于摇床100-115 rpm培养，温度保持26-32℃，按5-15g/100mL比例，湿重，每7-10d继代一次，生长速度3-4倍/7d；/n所述的悬浮培养基CM2指的是：B5 + 0.5-1 mg/L 2,4-D + 30g/L蔗糖 + 0.1mg/L Gln+ 0.2mg/L 水解乳蛋白，pH5.8-6.0；/n（6）沙漠蔷薇愈伤组织的一次性生物反应器培养：选取状态一致的已培养7d的悬浮培养材料，向5L一次性生物反应器中接入1000-1500 mL悬浮培养物和除菌处理的3500-4000mL 悬浮培养基CM2使终体积为5000 mL，振频为9.5次/min，通空气为0.1 m³/h，培养7d；继代时，将培养物接入新的一次性生物反应器，加入2-4倍体积的悬浮培养基CM2，振荡并通气培养，振荡频率范围为2-15次/min，通气量为0.05-0.3 m³/h，培养过程中反应器的振频为5-20次/min。/n...
【技术特征摘要】
1.一种快速的沙漠蔷薇愈伤组织诱导和规模化悬浮培养方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）沙漠蔷薇种子消毒：将沙漠蔷薇种子用常温水浸泡10-15min，剥除软质种皮，立刻置入4%次氯酸钠溶液消毒8-10min，无菌水洗涤4次，置于基础培养基BM上，27-29℃培养，光照强度＜1000lux；所述的基础培养基BM指的是：1/2MS或MS+30g/L蔗糖+0.1mg/LGln+0.2mg/L水解乳蛋白，琼脂0.7-1.0%，pH5.8-6.0；
（2）沙漠蔷薇无菌苗培养：将已萌发的沙漠蔷薇无菌苗种子在基础培养基BM中培养至植株高2-3cm，开始快繁，快繁方式为将沙漠蔷薇无菌苗去除根部，移入快繁培养基PM，需要7-14d发生侧芽，待侧芽生长至1.5-2cm切下用于再次快繁或生根，培养过程温度控制在25℃-32℃，光照强度500-1500lux；
所述的快繁培养基PM指的是：MS+0.1-0.5mg/LIAA+0.2-0.5mg/L6-BA+30g/L蔗糖+0.1mg/LGln+0.2mg/L水解乳蛋白，琼脂0.7-1.0%，pH5.8-6.0；
（3）沙漠蔷薇愈伤组织诱导：将沙漠蔷薇的叶片或茎、根剪成0.5-1cm长的小段，置于愈伤诱导培养基CIM，26-32℃培养，光照强度＜1000lux，7-14d即在切口边缘形成白色疏松的愈伤组织；所述的愈伤诱导培养基CIM指的是B5+1-2mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+0.1mg/LGln+0.2mg/L水解乳蛋白，琼脂0.7-1.0%，pH5.8-6.0；
（4）沙漠蔷薇愈伤组...
【专利技术属性】
技术研发人员：王鹏，张玉洁，刘水燕，张卫，
申请(专利权)人：安赛搏重庆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50
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