一种加倍非洲菊单倍体植株的方法技术

本发明专利技术公开一种加倍非洲菊单倍体植株的方法，该方法包括非洲菊单倍体组培繁殖苗经过壮苗和增殖培养、化学诱变培养、复壮培养、变异植株筛选、初选植株保种、扩繁、生根培养、诱变株系复选、气孔保卫细胞叶绿体计数法鉴定、根尖染色体计数法鉴定，最终确定双单倍体植株。通过优化非洲菊单倍体的加倍培育和鉴定流程，在提高单倍体植株变异率的同时，保障倍性鉴定的准确性。本发明专利技术能有效减少嵌合体的形成和干扰，减轻化学药物对植物的伤害，即降低加倍植株的死亡率，又使单倍体植株的变异率保持在60～80％之间，为非洲菊新品种选育提供性状优良、稳定的双单倍体。

A method of doubling haploid plants of Gerbera jamesonii

【技术实现步骤摘要】
一种加倍非洲菊单倍体植株的方法
本专利技术涉及一种加倍非洲菊单倍体植株的方法，属于植物生物

技术介绍
非洲菊(GerberaHybrida)属菊科大丁草属多年生宿根草本花卉，别名扶郎花，有“扶持郎君，事业发达”之意，可制作花篮、花束及其它花卉饰品，由于其色泽鲜艳、花色丰富，成为周年供应不可缺少的切花。自交系间杂种的优势比品种间杂种优势大，而非洲菊为典型的异花授粉作物，由于长期无性繁殖，保存着基因型的高度杂合性，其性状遗传极为复杂。为了克服非洲菊品种的杂合状态，充分利用杂种优势，排除显隐性的干扰，提高选择的准确性，必须通过人工控制授粉，强迫自交，提高亲本的纯合性。通常情况下，要获得纯合的自交系，需进行多代(4～6代)，甚至10代以上的自交，花费6～7年甚至8～9年的时间。通过花药或未授粉子房(或胚珠)培养可得单倍体植株，单倍体植株经染色体加倍后，可快速成为纯合二倍体，提高育种效率。目前，不管是多倍体育种中人工诱导多倍体，还是单倍体育种中对单倍体植株的愈伤组织或胚状体进行染色体加倍，多采用化学诱导法，而秋水仙碱是应用最为广泛的染色体加倍试剂，但其也有明显的缺点。一是秋水仙素的毒性大，是一种神经性毒剂，对人、畜及环境存在较大的安全隐患；二是由于秋水仙碱清除困难，毒害植物材料，严重抑制了植物的生长发育；三是残留的秋水仙碱可能导致产生额外染色体加倍，被加倍的细胞可以被重复加倍，这就会引起含有不同倍数水平的染色体植株出现；四是秋水仙碱与植物微管蛋白的亲和力较低，不易作用于分生组织细胞，使用剂量较高，会导致试验材料的死亡，但处理浓度过低，则达不到染色体加倍的效果，诱变率较低；五是秋水仙碱比较昂贵，使得实验或者生产成本提高。因此，需有寻找一种低毒性、低成本、高效率诱导染色体加倍的化学试剂来替代秋水仙碱，对现有加倍非洲菊单倍体植株方法进行改善，为非洲菊育种研究提供理想材料。
技术实现思路
为解决当前秋水仙碱加倍单倍体存在的化学诱变剂毒性大、价格昂贵等问题，本专利技术根据非洲菊单倍体生长特性，提供一种加倍非洲菊单倍体植株的方法。本专利技术所提供的一种加倍非洲菊单倍体植株的方法，包括以下步骤：A、壮苗和增殖培养将非洲菊单倍体组培繁殖苗切成单株，转接到下列壮苗和增殖培养基中进行壮苗和增殖同步培养：MS改良培养液所述的MS改良培养液是：MS培养液中大量元素的浓度减半，盐酸硫胺素浓度为2mg/L，盐酸吡哆醇浓度为1mg/L的培养液；培养条件为：光照强度1800～2200lx，温度25℃±2℃，光照时间10h/d；培养时间为：35～45d；B、化学诱变培养将A步骤培养的幼苗切成苗高为0.8～1.2cm的单株，完全浸泡于化学诱变剂中，处理3～6h，处理完毕后，用无菌水浸泡20min，再用无菌水漂洗3次，接种到下列诱变培养基中培养：1/2MS培养液所述诱变剂母液由下述方法配制而得：先将0.5g氨磺乐灵溶于50g二甲基亚砜中，再加蒸馏水定容至1L，即得诱变剂母液；所述化学诱变剂由下述方法配制而得：取上述10～30ml诱变剂母液，用蒸馏水稀释至100ml，在121℃下进行灭菌20min，待冷却至室温后，即得到化学诱变剂；培养条件为：光照强度1500～2000lx，温度25℃±2℃，光照时间8h/d；C、复壮培养和诱变植株初步筛选在B步骤诱变培养基中培养2～6d后，剔除坏死组织，转接到与步骤A相同的培养基和培养条件下进行复壮培养，培养至每个诱变单株新萌发出3～6个幼芽时，观察形态特征变化情况，和单倍体植株相比，株型变大、生长速度变快、叶片变大变厚的植株初步筛选为诱变植株，同时淘汰其它植株；D、初选植株保种、扩繁、生根培养及诱变株系第一次筛选将步骤C初选的诱变植株切成单株，分别编号，在与步骤A相同的培养基和培养条件下扩繁至20个芽，取其中5个芽在与步骤A相同的培养基和培养条件下保存，并进行扩繁，形成株系，其余15个芽接种到下述生根培养基中：1/2MS培养液在光照强度为1500～2000lx，温度为25℃±2℃，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养，并观察根系萌发时间，诱变植株根系萌发所需时间比单倍体植株根系萌发时间短3d以上，将根系萌发时间变短的株系第一次拟定为诱变株系，同时淘汰其它株系；E、诱变株系第二次筛选当D步骤第一次拟定的诱变株系生根培养至基部长出4～8条根时，先采用气孔保卫细胞叶绿体计数法对生根苗进行倍性鉴定，和单倍体植株相比，诱变株系植株的气孔保卫细胞叶绿体数目比单倍体的气孔保卫细胞叶绿体数目平均增多1.4倍以上，诱变株系植株的气孔长和气孔宽平均值比单倍体的气孔长和气孔宽平均值分别增加1.4倍以上和1.8倍以上，保卫细胞中叶绿体数目、气孔长度和气孔宽度增加数均满足上述要求的第二次拟定为诱变株系，同时淘汰其它株系；F、双单倍体株系的确定采用根尖染色体计数法对E步骤第二次拟定的诱变株系植株进行倍性鉴定，根尖染色体数目为2n＝2x＝50确定为双单倍体株系，淘汰根尖染色体数目为2n＝x＝25的株系。将步骤A增殖培养的植株预留20株，不经过步骤B的化学诱变培养，只在与步骤A和步骤D相同的培养基和培养条件下，同步进行增殖和生根培养，便于将诱变植株和单倍体植株进行同步对比，作出准确判断，在步骤C、步骤D、步骤E和步骤F进行倍性鉴定时，将培养的单倍体植株作为所述判断诱变植株或诱变株系的对照，其中：步骤C中所述诱变植株的判断特征是：株型、生长速度、叶片大小和厚度；步骤D中所述诱变株系植株的判断特征是：根系萌发时间；步骤E中所述诱变株系植株的判断特征是：气孔保卫细胞气孔叶绿体数目、气孔长和气孔宽；步骤F中所述诱变株系植株的判断特征是：根尖染色体数目。步骤E所述的气孔保卫细胞叶绿体计数法是取D步骤第一次拟定的诱变株系，选取其生根苗植株中部叶片，置于载玻片上，并在载玻片中央滴1滴碘液，用尖细小镊子轻轻撕取中部叶片下表皮，放在载玻片上，充分展平后盖上盖玻片，轻轻压平，置于目镜10X物镜20倍或目镜10X物镜40倍或目镜10X物镜100倍的显微镜下观察，每个株系随机选取10个以上叶绿体分散清晰的气孔，对保卫细胞中叶绿体数目进行计数，并测量气孔长度、气孔宽度；所述碘液配制方法为：1g碘加2g碘化钾，用蒸馏水定容至100ml。步骤F所述的根尖染色体计数法是选择E步骤第二次拟定的诱变株系,切取刚长出0.8-1.2cm的根尖，先经0.002mol/L的8-羟基喹啉在常温下处理6h，无菌水冲洗2次后，用无水乙醇和冰醋酸体积比为3:1的乙醇冰醋酸混合液固定1h，95％乙醇溶液冲洗2次，放入装有1mol/L盐酸的离心管中，于60℃的水浴锅中恒温解离7min，用无菌水冲洗根尖3次后，置于载玻片上，将根尖切小至0.2-0.5cm长，用卡宝品红染色10min，滴1滴45％乙酸溶液，用镊子把根尖压碎后，盖上盖玻片，用滤纸吸去多余的染色液，压片后，盖玻片四本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种加倍非洲菊单倍体植株的方法，其特征在于：/nA、壮苗和增殖培养/n将非洲菊单倍体组培繁殖苗切成单株，转接到下列壮苗和增殖培养基中进行壮苗和增殖同步培养：/nMS改良培养液/n

【技术特征摘要】
1.一种加倍非洲菊单倍体植株的方法，其特征在于：
A、壮苗和增殖培养
将非洲菊单倍体组培繁殖苗切成单株，转接到下列壮苗和增殖培养基中进行壮苗和增殖同步培养：
MS改良培养液



所述的MS改良培养液是：MS培养液中大量元素的浓度减半，盐酸硫胺素浓度为2mg/L，盐酸吡哆醇浓度为1mg/L的培养液；
培养条件为：光照强度1800～2200lx，温度25℃±2℃，光照时间10h/d；
培养时间为：35～45d；
B、化学诱变培养
将A步骤培养的幼苗切成苗高为0.8～1.2cm的单株，完全浸泡于化学诱变剂中，处理3～6h，处理完毕后，用无菌水浸泡20min，再用无菌水漂洗3次，接种到下列诱变培养基中培养：
1/2MS培养液



所述诱变剂母液由下述方法配制而得：先将0.5g氨磺乐灵溶于50g二甲基亚砜中，再加蒸馏水定容至1L，即得诱变剂母液；
所述化学诱变剂由下述方法配制而得：取上述10～30ml诱变剂母液，用蒸馏水稀释至100ml，在121℃下进行灭菌20min，待冷却至室温后，即得到化学诱变剂；
培养条件为：光照强度1500～2000lx，温度25℃±2℃，光照时间8h/d；
C、复壮培养和诱变植株初步筛选
在B步骤诱变培养基中培养2～6d后，剔除坏死组织，转接到与步骤A相同的培养基和培养条件下进行复壮培养，培养至每个诱变单株新萌发出3～6个幼芽时，观察形态特征变化情况，和单倍体植株相比，株型变大、生长速度变快、叶片变大变厚的植株初步筛选为诱变植株，同时淘汰其它植株；
D、初选植株保种、扩繁、生根培养及诱变株系第一次筛选
将步骤C初选的诱变植株切成单株，分别编号，在与步骤A相同的培养基和培养条件下扩繁至20个芽，取其中5个芽在与步骤A相同的培养基和培养条件下保存，并进行扩繁，形成株系，其余15个芽接种到下述生根培养基中：
1/2MS培养液



在光照强度为1500～2000lx，温度为25℃±2℃，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养，并观察根系萌发时间，诱变植株根系萌发所需时间比单倍体植株根系萌发时间短3d以上，将根系萌发时间变短的株系第一次拟定为诱变株系，同时淘汰其它株系；
E、诱变株系第二次筛选
当D步骤第一次拟定的诱变株系生根培养至基部长出4～8条根时，先采用气孔保卫细胞叶绿体计数法对生根苗进行倍性鉴定，和单倍体植株相比，诱变株系植株的气孔保卫细胞叶绿体数目比单倍体的气孔保卫细胞叶绿体数目平均增多1.4倍以上，诱变株系植株的气孔长和气孔宽平均值比单倍体的气孔...

【专利技术属性】
技术研发人员：单芹丽，李绅崇，杨春梅，瞿素萍，吴丽芳，吴学尉，汪国鲜，阮继伟，卢珍红，
申请(专利权)人：云南省农业科学院花卉研究所，玉溪云星生物科技有限公司，云南大学，
类型：发明
国别省市：云南;53