一种高效的百合脱毒方法技术

本发明专利技术公开了一种高效的百合脱毒方法，该方法包括以下步骤：1)选取健康无腐烂的百合鳞片提取RNA，经反转录进行病毒检测；2)选取中内层健康的百合鳞片进行外植体消毒，培养获得大量长势良好的无菌苗；3)切取无菌苗小鳞片，诱导获得致密愈伤组织；4)愈伤组织经过分化培养诱导成苗；5)切取步骤4)中的叶进行病毒检测，检测合格即为百合脱毒种苗。本发明专利技术的百合脱毒方法通过诱导愈伤组织快速获得无毒苗，解决了目前百合脱毒工序复杂、技术要求高和耗时长的问题，具有脱毒效率高、工序简单、生产设备要求低的特点，能够满足产业化生产的需求。

An efficient detoxification method of Lily

【技术实现步骤摘要】
一种高效的百合脱毒方法
本专利技术属于植物组织培养及脱毒
，涉及一种百合脱毒方法，具体涉及一种通过诱导愈伤进行脱毒的百合脱毒方法。
技术介绍
百合作为球根花卉，在花卉家族中占有非常重要的地位。但其长期采用以鳞茎、鳞片、珠芽等营养体进行无性繁殖，极易发生病毒感染，且常伴有球根退化，严重影响百合的品质和产量。其中，病毒病是近年来世界范围内发生的主要病害之一。随着我国百合的进口、引种、种植面积的迅速增加，以及种球的不规范种植和自繁，病毒病开始在我国百合种植区蔓延。一般发病率在40％-50％，二代种球的带病率在90％以上。在已报道的十余种侵染百合的病毒中，发生最为普遍、危害最为严重的病毒有3种：黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、百合无症病毒(Lilysymptomlessvirus，LSV)和百合斑驳病毒(Lilymottlevirus，LMoV)，它们经常以复合感染的形式出现，使植株的茎、叶、花发生斑驳或变形，严重导致植株矮小、退化甚至死亡，严重影响百合的产量和品质。这些病毒主要通过蚜虫等昆虫媒介传播，传播速度快，难以用化学药剂或生物药剂直接有效控制。目前关于百合脱毒技术的研究主要集中在剥茎尖、热处理和化学处理等技术的综合应用，这些方法虽然能有效脱除百合病毒。但存在所需脱毒材料较多、污染率高、技术难度操作较大、工序复杂、周期长等问题，难以满足规模化生产的要求。例如，专利号为CN201410420844.1的中国专利“一种基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法”，它将大田百合鳞片经消毒后诱导出愈伤组织，诱导成苗后进行热处理，剥离茎尖后再次诱导愈伤组织，再将其诱导成苗。该脱毒方法存在的问题是：脱毒材料需求量极大，茎尖剥取不易且成活率低，工序复杂，耗时长，技术要求高，难以应用于工厂化生产。此外，专利号为CN201410586353.4的中国专利“一种百合种球综合性脱毒方法”，它先以36-38℃，湿度为70-86％的大棚环境条件进行热处理脱毒，后进行外植体的消毒和生长点采集诱导培养，该脱毒方法存在的问题是：设备成本高，生长点剥取不易，技术难度大，形成的脱毒鳞茎种球退化严重，虽然能够脱除一部分的病毒，但易二次感染病毒，故实际应用价值低。此外，已有专利基本未对处理前的百合种球进行病毒检测以确认原材料是否感染病毒，因此其脱毒率的统计有失一定的科学性。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有百合脱毒技术的不足，在脱毒处理前就进行病毒检测，提供一种可持续化高、易操作、周期短且能够应用于规模化生产百合的脱毒方法，该方法能有效提高种苗抗性，具有操作简单、工序少、脱毒时间短等优势。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种高效的百合脱毒方法，该方法包括以下步骤：1)选取健康无腐烂的百合鳞片提取RNA，经反转录进行病毒检测；2)选取中内层健康的百合鳞片进行外植体消毒，培养获得大量长势良好的无菌苗；3)切取无菌苗小鳞片，诱导获得致密愈伤组织；4)愈伤组织经过分化培养诱导成苗；5)切取步骤4)中的叶进行病毒检测，检测合格即为百合脱毒种苗。作为一种优选技术方案：步骤1)中进行病毒检测的详细过程为：选取无腐烂、健康的百合鳞片冻入液氮中，采用Trizol法提取RNA；后用takara反转录试剂盒进行反转录；设计黄瓜花叶病毒、百合无症病毒以及百合斑驳病毒的引物进行PCR扩增，检测是否含有此三种病毒；RNA提取的重要试剂是Trizol。反转录中重要的试剂的Random6mers。步骤2)培养获得无菌苗的详细过程为：选取较少病斑的种球，剥取中内层健康的鳞片在流水下冲洗后依次经75％乙醇和1％次氯酸钠消毒，再经灭菌ddH2O冲洗多次，倒置于滤纸上晾干；将鳞片切成方块，凹面向上置于诱芽培养基中，放至组培室条件下生长；步骤3)切取无菌苗小鳞片，诱导获得致密愈伤组织的详细过程为：将长至3-8cm高的植株切去叶片，剥其小鳞片凹面朝上放至诱导愈伤培养基中；放至组培室条件下生长；步骤4)愈伤组织经过分化培养诱导成苗的详细过程为：将长成致密状态的愈伤组织切离出母体，继代1-2次后，转至分化培养基中；放至组培室条件下生长；步骤5)切取步骤4)中的叶进行病毒检测的详细过程为：对步骤4)中完成脱毒处理的百合小鳞茎随机抽取10-20％，进行RT-PCR反转录病毒检测，经检测确认不带黄瓜花叶病毒、百合无症病毒和百合斑驳病毒，即为百合脱毒苗。进一步优选的：步骤2)中剥取中内层健康的鳞片在流水下冲洗2个小时，75％乙醇消毒30秒，1％次氯酸钠消毒15-20分钟，经灭菌ddH2O冲洗5-8次，倒置于滤纸上晾干。步骤2)中所述的诱芽培养基为：MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+7g/L琼脂+15g/L蔗糖。步骤3)中所述的诱导愈伤培养基为：MS+1.0mg/LTDZ+2.0mg/LPIC+7g/L琼脂+15g/L蔗糖。步骤3)中小鳞片诱导愈伤的光照培养条件为黑暗，20℃。步骤4)中所述的分化培养基为：MS+0.4g/L活性炭+0.2mg/LNAA+9g/L琼脂+40g/L蔗糖。步骤4)中愈伤继代的转接间隔时间为10-15天。步骤4)中愈伤诱导成苗的培养条件为：光照强度为1500Lx，温度为20℃。本专利技术高效的百合脱毒方法的脱毒原理为：1)、以大田苗建立无菌苗过程中的步骤2)中可能脱去一部分病毒：以百合鳞片作为外植体，诱导出芽后，切取芽的部分进行增殖生长。芽的生长速度快于病毒的扩增速度，舍弃了含有病毒的母体，可能脱去一部分病毒。2)、以无菌苗的鳞片作为外植体诱导愈伤的步骤3)中又脱去了一部分病毒：以无菌苗的鳞片作为外植体，诱导愈伤组织，将致密的愈伤组织切离出母体后放至分化培养基中。致密愈伤组织的生长速度远远大于病毒的扩增速度，并舍弃了含有病毒的母体部分，因此脱去了病毒。本专利技术研究表明，只是以大田苗建立培养无菌苗的过程是没办法彻底同时脱掉三种病毒，只有两个步骤结合才能同时脱去三种病毒。本专利技术技术方案的创新点：1)、与现有
技术实现思路
相比，大多数的专利技术采取的方法大多以茎尖作为外植体，经热处理后再一次切取茎尖等，操作难度大且步骤冗杂，本研究中利用了无菌苗的鳞片，经一次愈伤组织的培养，就成功获得了脱毒苗，实际操作容易，步骤少。鳞片作为愈伤诱导的外植体，愈伤诱导率高、获得的愈伤组织状态好。因此本研究具明显的创新。2)、本研究中应用的愈伤组织诱导的培养基是首创的，MS+1.0mg/LTDZ+2.0mg/LPIC+15g/L蔗糖+7g/L琼脂。常规的愈伤诱导培养基内，常添加是PIC或是2，4-D，本专利技术将TDZ和PIC结合一起使用。利用愈伤诱导进行脱毒，愈伤组织的状态是脱毒成功的关键，在该培养基的诱导下，我们得到的是致密、生长快速的胚性愈伤组织(如图1所示)。3)、在经历近两年多的摸索后，本研究发现经鳞片诱导的愈伤组织在转接10-15天后诱导分化的脱毒效果是最好的，在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效的百合脱毒方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：/n1)选取健康无腐烂的百合鳞片提取RNA，经反转录进行病毒检测；/n2)选取中内层健康的百合鳞片进行外植体消毒，培养获得大量长势良好的无菌苗；/n3)切取无菌苗小鳞片，诱导获得致密愈伤组织；/n4)愈伤组织经过分化培养诱导成苗；/n5)切取步骤4)中的叶进行病毒检测，检测合格即为百合脱毒种苗。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效的百合脱毒方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
1)选取健康无腐烂的百合鳞片提取RNA，经反转录进行病毒检测；
2)选取中内层健康的百合鳞片进行外植体消毒，培养获得大量长势良好的无菌苗；
3)切取无菌苗小鳞片，诱导获得致密愈伤组织；
4)愈伤组织经过分化培养诱导成苗；
5)切取步骤4)中的叶进行病毒检测，检测合格即为百合脱毒种苗。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)中进行病毒检测的详细过程为：选取无腐烂、健康的百合鳞片冻入液氮中，采用Trizol法提取RNA；后用takara反转录试剂盒进行反转录；设计黄瓜花叶病毒、百合无症病毒以及百合斑驳病毒的引物进行PCR扩增，检测是否含有此三种病毒；
步骤2)培养获得无菌苗的详细过程为：选取较少病斑的种球，剥取中内层健康的鳞片在流水下冲洗后依次经75％乙醇和1％次氯酸钠消毒，再经灭菌ddH2O冲洗多次，倒置于滤纸上晾干；将鳞片切成方块，凹面向上置于诱芽培养基中，放至组培室条件下生长；
步骤3)切取无菌苗小鳞片，诱导获得致密愈伤组织的详细过程为：将长至3-8cm高的植株切去叶片，剥其小鳞片凹面朝上放至诱导愈伤培养基中；放至组培室条件下生长；
步骤4)愈伤组织经过分化培养诱导成苗的详细过程为：将长成致密状态的愈伤组织切离出母体，继代1-2次后，转至分化培养基中；放至组培室条件下生长；
步骤5)切取步骤4)中的叶进行病毒检测的详...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕年军，吴慧君，吴泽，张德花，蓝令，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32