一种无刺花椒组培苗的继代繁育方法技术

本发明专利技术公开了一种无刺花椒组培苗的继代繁育方法，属于经济作物无性繁殖技术领域。具体包括以下步骤：初代培养、切割和继代增殖培养，继代增殖培养直至培养基中PPM用量降为0时结束，且继代增殖培养代数不少于4代。本发明专利技术的无刺花椒组培苗的继代繁育方法，通过对培养条件的优化，根据继代培养的次数适当调整培养基成分组成，以及特殊切割工艺等因素的综合研究，建立了无刺花椒组培种苗继代培养的技术体系，使得无刺花椒初代培养的茎段快速稳定的实现继代增殖，从而在短时间内实现大规模的繁育，在无刺花椒繁育生产中具有极大的实用价值。

A method of subculture of tissue culture seedlings of Zanthoxylum bungeanum

【技术实现步骤摘要】
一种无刺花椒组培苗的继代繁育方法
本专利技术属于经济作物无性繁殖
，具体涉及一种无刺花椒组培苗的继代繁育方法。
技术介绍
花椒是芸香科花椒属(ZanthoxylumLinn.)的一种香料植物，在我国有悠久的栽培历史，既是香料植物也是传统的药用植物，栽培花椒兼具很高的经济价值和水土保持效益。花椒在我国分布于黄河、长江、珠江流域各省及云南、贵州和西藏等地，按照商品类型可区分为北方红花椒、南方青花椒及产于山东的香花椒。我国现已栽种花椒约200万hm2，年总产值约600亿元，花椒已成为支撑我国5000多万山区农民经济来源的支柱型经济树种。然而，由于花椒树干、枝、叶具刺，导致采收困难、成本极高。2011年花椒的采收成本约占销售收入的1/2-2/3，全国200万hm2花椒的年采收成本达300-400亿元。因此，花椒采收难已是花椒生产中亟待解决的关键问题，若能以无刺花椒品种替代有刺花椒，将会大幅度的提高采收效率、节约采收成本。20世纪50年代以来，我国先后进行花椒品种改良，并断断续续进行了无刺花椒品种发掘和培育研究。20世纪80年代初，我国从日本引进了“日本无刺花椒”，试栽于河北、河南等地，1994年日本在四川实施援助项目时也将其引入四川，2010年又自河北引入陕西凤县；由于“日本无刺花椒”与我国的花椒有本质的不同，其麻香味不足、产量不高、果面腺点深陷口状、抗寒性弱，我国南方的青花椒、北方的红花椒麻香味浓烈、高产、果面腺点泡状鼓出，因而一直未能在我国花椒生产中推广栽培。目前，无刺花椒树的繁育方法主要为嫁接繁殖，但是嫁接周期比较长，受外界环境条件和病虫害影响大，使得嫁接无刺花椒的苗木质量差、成活率低，从而影响了花椒的质量和产量。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种无刺花椒组培苗的继代繁育方法。以解决无刺花椒采用嫁接繁殖的成活率低和产量低的问题，为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种无刺花椒组培苗的继代繁育方法，包括以下步骤：S1、初代培养：将无刺花椒萌芽茎段置于培养基中，并在黑暗环境中培养5～9天，再置于光照强度为900～1100lux条件下培养6～8天，然后将光照强度增加至1900～2100lux培养12～16天，直至无刺花椒萌芽茎段生长至高度3～4cm，3～4个节间，且腋芽萌发数量不少于2个；S2、切割：将经过初代培养的无刺花椒萌芽茎段置于超净工作台上的无菌接种盘中，用灭菌的工具将无刺花椒萌芽茎段的基部即浸入培养基的一端的组织切除，露出新鲜组织，然后切成1～3片叶茎段；S3、第二代培养：将S2中切割好的茎段置于培养基中，并在黑暗环境中培养5～9天后，及时置于光照强度为900～1100lux条件下培养6～8天，然后将光照强度增加至1900～2100lux培养12～16天，直至茎段生长至高度3～4cm，3～4个节间，且腋芽萌发数量不少于2个；所述初代培养和第二代培养过程中的培养基成分组成为：MS基础培养基、玉米素(ZT)为2.0mg·L-1、萘乙酸(NAA)为0.1mg·L-1、卡拉胶为6.0g·L-1、蔗糖为30g·L-1和植物组培抗菌剂为(PPM)0.1％；S4、重复S2和S3步骤进行继代增殖培养，直至培养基中PPM用量为0时结束，且继代增殖培养代数不少于4代；所述继代增殖培养的培养基成分组成为：MS基础培养基、ZT为1.0～2.0mg·L-1、NAA为0.1mg·L-1、卡拉胶为6.0g·L-1、蔗糖30g·L-1和PPM为0～0.05％；所述继代增殖培养代数每增加1～2次，PPM用量降低0.01％。其中，无刺花椒萌芽茎段材料为无刺花椒树苗上切取的2～3cm的茎段，在培养基中培养30～40d后生长出的萌芽茎段。无刺花椒萌芽茎段在培养过程中，开始采用黑暗条件培养的目的之一为避免新切割的茎段切口处发生褐变，且黑暗条件培养有利于茎段芽的生长，目的之二为防止新切割的茎段生长过快和老化，目的之三为无刺花椒本体是从有刺花椒嫁接而成，在黑暗条件培养可防止茎段生长出带刺腋芽。经过一段时间的黑暗条件培养之后，逐渐增加光照培养强度，使得茎段逐渐适应光照的条件，当茎段适应外界条件之后，再置于更强的光照条件下，使得茎段快速生长和老化。优选的，所述S4中，第三代培养和第四代培养的培养基成分中ZT用量均为2.0mg·L-1。优选的，所述S4中，继代增殖培养代数超过4代后，培养基成分中ZT用量需根据增殖的腋芽茎段节间长度和腋芽数量进行调整，当腋芽茎段密集且腋芽丛生时，ZT用量为1.0～1.25mg·L-1，当腋芽茎段节间长且腋芽萌发较少时，ZT用量为1.25～1.5mg·L-1。优选的，所述S4中，继代增殖培养过程中，PPM用量随着继代次数的增加每次减少0.01％。其中，继代增殖培养3～4代后，增殖的腋芽茎段逐渐适应了离体环境，同时体内的内生真菌已经得到了抑制，体内激素水平逐渐积累，此时需要根据情况适当调整继代增殖培养基成分组成，在原来MS基本培养基的基础上，随着继代增殖次数的不断增加，逐渐降低细胞分裂数和生长素的比例，同时逐渐减少PPM的用量，直至到0。优选的，所述S2中，无刺花椒苗在切割过程中，顶芽切成1～2cm长，带2～4片叶的茎段。优选的，所述S2中，无刺花椒苗在切割过程中，除靠近培养基水渍状、黄花的老叶片需切除外，其余所有叶片均需保留。其中，切割工艺是无刺花椒能否高效继代增殖的关键因素之一。同样的材料，采用不同的切割方法，后续的增殖差异很大。因此，无刺花椒继代增殖的切割工艺重点包括以下四点：1)将待切割的材料置于超净工作台上的无菌接种盘中，首先用灭菌好的工具将茎段基部(插入培养基的一端)的老组织切除，露出新鲜的组织；2)按照腋芽微型增殖的方式进行切割。即是将3-4cm的茎段材料切成带1-3片叶的茎段，具体根据茎段腋芽的萌发情况而定。若茎段节间较长，且腋芽萌发较好，则可切割成1叶1芽的茎段；若茎段节间较紧密，且腋芽萌发不够长，则可选择切成2-3片的茎段；3)茎段顶芽一般切成1-2cm长，带2-4片叶的茎段；4)除靠近培养基水渍状、黄花的老叶片需要切除外，其余所有叶片均需要完整保留下来。在切割过程中，如果不切除无刺花椒萌芽茎段的基部以及靠近培养基水渍状、黄花的老叶片，会造成茎段继代增殖培养过程中基部和老叶吸收营养，使得新茎段增殖缓慢，同时还会造成部分生长弱的茎段枯萎。优选的，在整个继代增殖培养期间，每天的光照培养时间为10h，温度为23～27℃。本专利技术的有益效果在于：1)本专利技术的无刺花椒组培苗的继代繁育方法，采用先黑暗培养再逐渐增强光照强度，可使组培苗内部的激素逐渐趋于稳定，采用特殊的切割工艺，可大大减少继代增殖培养的代数，从而达到快速繁殖无刺花椒树苗的目的；2)本专利技术的无刺花椒组培苗的继代繁育方法，通过对培养条件的优化，根据继代培养的次数适当调整培养基成分组成，以及特殊切割工艺等因素的综合研究，建立了无刺花椒组培种苗继代培养的技术体系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无刺花椒组培苗的继代繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、初代培养：将无刺花椒萌芽茎段置于培养基中，并在黑暗环境中培养5～9天，再置于光照强度为900～1100lux条件下培养6～8天，然后将光照强度增加至1900～2100lux培养12～16天，直至无刺花椒萌芽茎段生长至高度3～4cm，3～4个节间，且腋芽萌发数量不少于2个；/nS2、切割：将经过初代培养的无刺花椒萌芽茎段置于超净工作台上的无菌接种盘中，用灭菌的工具将无刺花椒萌芽茎段的基部即浸入培养基的一端的组织切除，露出新鲜组织，然后切成1～3片叶茎段；/nS3、第二代培养：将S2中切割好的茎段置于培养基中，并在黑暗环境中培养5～9天后，及时置于光照强度为900～1100lux条件下培养6～8天，然后将光照强度增加至1900～2100lux培养12～16天，直至茎段生长至高度3～4cm，3～4个节间，且腋芽萌发数量不少于2个；/n所述初代培养和第二代培养过程中的培养基成分组成为：MS基础培养基、玉米素(ZT)为2.0mg·L-

【技术特征摘要】
1.一种无刺花椒组培苗的继代繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、初代培养：将无刺花椒萌芽茎段置于培养基中，并在黑暗环境中培养5～9天，再置于光照强度为900～1100lux条件下培养6～8天，然后将光照强度增加至1900～2100lux培养12～16天，直至无刺花椒萌芽茎段生长至高度3～4cm，3～4个节间，且腋芽萌发数量不少于2个；
S2、切割：将经过初代培养的无刺花椒萌芽茎段置于超净工作台上的无菌接种盘中，用灭菌的工具将无刺花椒萌芽茎段的基部即浸入培养基的一端的组织切除，露出新鲜组织，然后切成1～3片叶茎段；
S3、第二代培养：将S2中切割好的茎段置于培养基中，并在黑暗环境中培养5～9天后，及时置于光照强度为900～1100lux条件下培养6～8天，然后将光照强度增加至1900～2100lux培养12～16天，直至茎段生长至高度3～4cm，3～4个节间，且腋芽萌发数量不少于2个；
所述初代培养和第二代培养过程中的培养基成分组成为：MS基础培养基、玉米素(ZT)为2.0mg·L-1、萘乙酸(NAA)为0.1mg·L-1、卡拉胶为6.0g·L-1、蔗糖为30g·L-1和植物组培抗菌剂为(PPM)0.1％；
S4、重复S2和S3步骤进行继代增殖培养，直至培养基中PPM用量为0时结束，且继代增殖培养代数不少于4代；
所述继代增殖培养的培养基成分组成为：MS基础培养基、ZT为1.0～2.0mg·L-1、NAA为0.1mg·L-1、卡拉胶为6.0g·L-1、蔗糖3...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈泽雄，唐宁，娄娟，许锋，刘霞，刘华敏，
申请(专利权)人：重庆文理学院，长江大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50