一种特异性识别19-去甲睾酮的纳米抗体NT8及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性识别19‑去甲睾酮的纳米抗体NT8及其应用。本发明专利技术筛选得到了一种能与19‑NT特异性结合的纳米抗体NT8，所述纳米抗体NT8的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该纳米抗体NT8具有较高的热稳定性和有机耐受性，检测19‑NT的范围为0.48ng/mL～4.93ng/mL，IC50为1.53ng/mL，最低检测限(LOD)为0.13ng/mL，检测灵敏度强；基于该纳米抗体NT8，本发明专利技术还提供了一种19‑去甲睾酮免疫学检测方法，该方法应用于19‑NT残留的实际样品检测时的操作简单、所耗时间短、灵敏度强、准确度高；因此，该纳米抗体NT8在检测19‑去甲睾酮或制备19‑去甲睾酮检测试剂/试剂盒中具有广泛的应用前景。

A nano antibody nt8 for specific recognition of 19 nortestosterone and its application

【技术实现步骤摘要】
一种特异性识别19-去甲睾酮的纳米抗体NT8及其应用
本专利技术属于生物
更具体地，涉及一种特异性识别19-去甲睾酮的纳米抗体NT8及其应用。
技术介绍
19-去甲睾酮(19-nortestosterone，19-NT)简称诺龙，是睾酮甾环结构上脱去第19位碳原子而形成的内源性和外源性蛋白同化激素。1950年Birch首先合成外源性19-NT，随后Wilds和Nelson在1953年也成功合成，并广泛地应用于血液学疾病，恶病质和黄体酮替换治疗，以及人和动物的蛋白质缺陷型疾病、骨质疏松症和烧伤治疗等。研究还发现，19-NT具有很强的促蛋白质合成能力，能参与生长发育的生理调节，促进骨骼和肌肉的生长，减少脂肪贮积。因此，许多国家和地区将19-NT用作畜禽生长促进剂，以改善生产性能，提高饲料报酬。运动员服用19-NT后，能增强肌肉力量，结合适度的锻炼和饮食，可提高比赛成绩。然而，20世纪70年代末，一系列事故使人们认识到激素残留的危害。研究表明，19-NT及其代谢物残留可影响人的肝脏功能，损害心血管系统，还可造成生殖器官受损、肾上腺萎缩、情绪失控及内分泌失调等毒副作用。这就要求对食源性动物生产进行严格的激素滥用监测，以保护消费者的身心健康。因此，急需要一种快速、灵敏、高效的检测方法来实现对19-NT的快速检测。常见的检测19-NT的方法包括气相色谱-质谱法、液相色谱质谱联用法以及其他定量检测方法，但这些方法需要专业的技术人员、繁琐的样品前处理过程和昂贵的仪器设备，不适合大批量市场检测和现场监控。而免疫学检测技术灵敏度强、特异性强、操作简单、价格低廉，能够实现对生物液体的小体积、大通量检测，逐渐成为有毒有害残留物检测的替代方法。目前，免疫学检测主要以单克隆抗体和多克隆抗体为主，但是极端条件下抗体稳定性差，造成基于抗体建立的免疫分析方法准确性差，因此提供一种稳定性好、检测结果准确度高的快速检测19-NT的方法，对19-NT的残留检测和监控具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有19-NT的检测方法的缺陷和不足，提供一种特异性识别19-去甲睾酮的纳米抗体NT8及其应用。本专利技术的第一个目的是提供一种特异性识别19-去甲睾酮的纳米抗体NT8。本专利技术的第二个目的是提供一种编码所述纳米抗体NT8的基因。本专利技术的第三个目的是提供一种重组载体。本专利技术的第四个目的是提供一种重组细胞。本专利技术的第五个目的是提供所述纳米抗体NT8、所述基因、所述重组载体或所述重组细胞在检测19-去甲睾酮中的应用。本专利技术的第六个目的是提供所述纳米抗体NT8、所述基因、所述重组载体或所述重组细胞在制备19-去甲睾酮检测试剂/试剂盒中的应用。本专利技术的第七个目的是提供一种19-去甲睾酮免疫学检测方法。本专利技术的第八个目的是提供一种19-去甲睾酮检测试剂盒。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术提供了一种特异性识别19-去甲睾酮的纳米抗体NT8，所述纳米抗体NT8的VHH的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术通过用噬菌体展示技术，从骆驼免疫抗体文库中筛选得到了一种能与19-NT特异性结合的纳米抗体NT8，该纳米抗体NT8能够特异性识别19-NT。所述纳米抗体NT8包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述4个框架区和3个互补决定区的排列顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4；其中，所述FR1的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，所述CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。本专利技术还提供了一种编码所述纳米抗体NT8的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。本专利技术还提供了一种重组载体，所述重组载体连接有所述的基因。本专利技术还提供了一种重组细胞，所述重组细胞为携带有所述重组载体或能够表达所述纳米抗体NT8的细胞。所述纳米抗体NT8、所述基因、所述重组载体或所述重组细胞在检测19-去甲睾酮中的应用、在制备19-去甲睾酮检测试剂/试剂盒中的应用，均应在本专利技术的保护范围之内。另外，本专利技术还提供了一种19-去甲睾酮免疫学检测方法，用含有式(I)所述19-去甲睾酮半抗原与载体蛋白偶联得到的19-去甲睾酮完全抗原做包被原，用所述的纳米抗体NT8作为检测抗体进行检测。优选地，所述19-去甲睾酮半抗原的结构式如式(I)所示：本专利技术还提供了一种19-去甲睾酮检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的纳米抗体NT8。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术筛选得到了一种能与19-NT特异性结合的纳米抗体NT8，该纳米抗体NT8能够特异性识别19-NT，具有较高的热稳定性和有机耐受性，可提高19-NT免疫检测的灵敏度，检测19-NT的范围0.48ng/mL～4.93ng/mL，IC50为1.53ng/mL，最低检测限(LOD)为0.13ng/mL，检测灵敏度强；本专利技术还提供了一种19-去甲睾酮免疫学检测方法，该方法操作简单、所耗时间短，检测结果灵敏度强、准确度高，且该纳米抗体NT8的制备方法具有普遍适用性；因此，该纳米抗体NT8能够很好的应用于19-NT残留的实际样品检测，在检测19-去甲睾酮或制备19-去甲睾酮检测试剂/试剂盒中具有极高的应用价值。附图说明图1是特异性纳米抗体NT8的氨基酸序列及结构域划分示意图。图2是基于特异性纳米抗体NT8建立的间接竞争ELISA标准曲线图。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1骆驼免疫抗体文库的构建(1)完全抗原19-NT-KLH和19-NT-OVA的制备把结构式如式(I)所示的19-去甲睾酮半抗原与卵清白蛋白(OVA)和匙孔血蓝蛋白(KLH)通过活泼酯方法偶联，制备获得完全抗原19-NT-KLH和19-NT-OVA。19-去甲睾酮半抗原的结构式如式(I)所示：(2)骆驼的免疫用健康的骆驼作为实验动物，以19-NT-KLH作为免疫原，在骆驼背颈部进行皮下注射，每次免疫剂量为0.5mL(其中含有0.5mg免疫原)。首次免疫用0.5mL完全弗氏佐剂与免疫原乳化后用于免疫，后续的加强免疫用0.5mL不完全弗氏佐剂与免疫原乳化后免疫，每次免疫间隔1～2周。免疫前取10mL血分离血清作为阴性对照。从第二次免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性识别19-去甲睾酮的纳米抗体NT8，其特征在于，所述纳米抗体NT8的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种特异性识别19-去甲睾酮的纳米抗体NT8，其特征在于，所述纳米抗体NT8的VHH的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种编码权利要求1所述纳米抗体NT8的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。


3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体连接有权利要求2所述的基因。


4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为携带有权利要求3所述重组载体或能够表达权利要求1所述纳米抗体NT8的细胞。


5.权利要求1所述纳米抗体NT8、权利要求2所述基因、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组细胞在检测19-去甲睾...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈玉栋，王弘，杨媛媛，张咏仪，陈浩宇，徐振林，肖治理，孙远明，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44