本发明专利技术涉及寡核苷酸组合物及其制备方法。本公开提供一种经由依次偶联循环来制备寡核苷酸的固相方法，所述方法包括二核苷酸二聚体亚基至少一次偶联于生长链的游离3'‑端基。所述寡核苷酸包含至少两个通过N3′→P5′磷酰胺酯键联连接的核苷亚基。所述方法可包括以下步骤：(a)使连接于固相支撑物的末端核苷的受保护的3'氨基脱保护，所述脱保护形成游离3'氨基；(b)使所述游离3'氨基与3'‑受保护的氨基‑二核苷酸‑5'‑亚磷酰胺二聚体在亲核催化剂存在下接触以形成核苷间N3’→P5’亚磷酰胺键联；以及(c)使所述键联氧化(例如硫化)。还提供包含主题寡核苷酸组合物的药物组合物。
【技术实现步骤摘要】
寡核苷酸组合物及其制备方法本申请是申请日为2015年04月29日、中国申请号为201580022353.4、专利技术名称为“寡核苷酸组合物及其制备方法”的专利技术申请的分案申请。相关申请的交叉引用根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2014年5月1日提交的美国临时申请序列第61/987,396号和2015年4月23日提交的美国临时申请序列第62/151,909号(代理人参考第185/002X号)的申请日的优先权，所述申请的公开内容以引用的方式并入本文。引言核酸聚合物化学已在医药、诊断和分析领域且更具体地说在反义和抗基因治疗学、组合化学、分支DNA信号放大以及基于阵列的DNA诊断学和分析中的许多开发中的技术中起作用。一些这种聚合物化学已涉及改进天然核酸聚合物如DNA的结合强度、特异性和核酸酶抗性。肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酰胺酯核苷间键联是已应用至寡核苷酸以提供一种或多种期望性质如核酸酶抗性、细胞摄取和溶解性的一些聚合物化学的实例。寡核苷酸N3'→P5'磷酰胺酯可与互补DNA和RNA链形成稳定双链体，以及与DNA双链体形成稳定三链体，并且对核酸酶具有抗性。已发现寡核苷酸N3'→P5'硫代磷酰胺酯在体外和体内用作有效反义剂。例如，含有抑制端粒酶活性的化合物的寡核苷酸可用于治疗端粒酶介导的病症(如癌症)，因为癌细胞表达端粒酶活性且正常人类体细胞不具有生物学相关水平下的端粒酶活性。因此，制备和分离此类寡核苷酸的方法是令人感兴趣的。概述本公开提供一种经由依次偶联循环制备寡核苷酸的固相方法，所述方法包括二核苷酸二聚体亚基至少一次偶联至生长链的游离3’-端基(例如，3’-羟基或3’-氨基)。主题方法包括制备寡核苷酸，其中至少两个核苷亚基通过N3′→P5′磷酰胺酯亚基间键联连接。所述方法可包括以下步骤：(a)使连接至固相支撑物的末端核苷的受保护的3'氨基脱保护，所述脱保护形成游离3'氨基；(b)使所述游离3'氨基与3'-保护的氨基-二核苷酸-5'-亚磷酰胺二聚体在亲核催化剂存在下接触以形成核苷间N3'→P5'亚磷酰胺键联；以及(c)使所述键联氧化。在一些情况下，使所述键联氧化包括硫化以产生核苷间N3'→P5'硫代磷酰胺酯键联。本公开的方面包括通过主题方法产生的寡核苷酸组合物，所述组合物包含减少量的一种或多种(N-x)寡核苷酸产物。在一些情况下，所述减少量是相对于N产物少于一种或多种(N-x)产物的(1.9xN)重量份至100重量份。根据主题方法制备的寡核苷酸包括具有与人端粒酶的RNA组分互补的N核苷亚基的序列的寡核苷酸，其中至少两个核苷亚基通过N3′→P5′硫代磷酰胺酯亚基间键联连接。还提供包含主题寡核苷酸组合物的药物组合物。本公开涉及下述实施方案。1.一种组合物，其具有相对于化合物或其盐少于4重量份中1重量份的(N-1)产物，其中所述化合物包含具有10个或更多个核苷亚基的序列的多核苷酸，并且至少两个所述核苷亚基通过N3′→P5′磷酰胺酯亚基间键联连接。2.如实施方案1所述的组合物，其中所述N3′→P5′磷酰胺酯亚基间键联是具有以下结构的N3′→P5′硫代磷酰胺酯亚基间键联：3′—NH—P(S)(OR)—O—5’其中R选自由以下组成的组：氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和磷酸酯保护基，或其盐。3.如实施方案1-2中任一项所述的组合物，其中所述化合物包含具有10个或更多个与人端粒酶的所述RNA组分互补的核苷亚基的序列的多核苷酸。4.如实施方案3所述的组合物，其中所述多核苷酸包含含有13个或更多个与人端粒酶的所述RNA组分互补的核苷亚基的序列。5.如实施方案3所述的组合物，其中所述多核苷酸包含在3个与50个之间的与人端粒酶的所述RNA组分互补的连续核苷亚基。6.如实施方案3-5中任一项所述的组合物，其中与人端粒酶的所述RNA组分互补的所述核苷亚基均通过N3′→P5′磷酰胺酯亚基间键联连接。7.如实施方案1-6中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：GTTAGGGTTAG(SEQIDNO:4)、TAGGGTTAGACAA(SEQIDNO:3)和CAGTTAGGGTTAG(SEQIDNO:5)。8.如实施方案1-7中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸包含3’氨基或3’-羟基端基。9.如实施方案7所述的组合物，其中所述化合物具有结构：或其盐；其中“nps”表示使一个核苷的3'-碳连接于相邻核苷的5'-碳的硫代磷酰胺酯键联—NH—P(═O)(SH)—O—。10.如实施方案9所述的组合物，其中所述盐是药学上可接受的盐。11.如实施方案7所述的组合物，其中所述化合物具有结构：其中各Mx+独立地是氢或盐的抗衡离子，各x独立地是1、2或3，且n是5至13的整数。12.如实施方案7所述的组合物，其中所述化合物具有结构：13.如实施方案1-12中任一项所述的组合物，其具有相对于所述化合物少于6重量份中1重量份的(N-1)产物。14.如实施方案13所述的组合物，其具有相对于所述化合物少于10重量份中1重量份的(N-1)产物。15.如实施方案14所述的组合物，其具有相对于所述化合物少于20重量份中1重量份的(N-1)产物。16.如实施方案1-15中任一项所述的组合物，其具有相对于所述化合物少于4重量份中1重量份的任何(N-x)产物。17.如实施方案16中任一项所述的组合物，其具有相对于所述化合物少于总共100重量份中40重量份的(N-x)含多核苷酸产物。18.如实施方案1-12中任一项所述的组合物，其具有(N-x)含多核苷酸产物的以下概况：相对于所述化合物少于4重量份中1重量份的(N-1)产物；相对于所述化合物至少100重量份中10重量份的(N-2)和(N-3)产物。19.一种化合物活性药物成分，其具有少于11重量％的(N-1)产物，其中所述化合物或其药学上可接受的盐包含具有10个或更多个与人端粒酶的RNA组分互补的核苷亚基的序列的多核苷酸，其中至少两个所述核苷亚基通过N3′→P5′磷酰胺酯亚基间键联连接。20.如实施方案19所述的化合物活性药物成分，其中与人端粒酶的所述RNA组分互补的所述核苷亚基均通过N3′→P5′硫代磷酰胺酯亚基间键联连接。21.如实施方案19-20中任一项所述的化合物活性药物成分，其中所述N3′→P5′磷酰胺酯亚基间键联是具有以下结构的N3′→P5′硫代磷酰胺酯亚基间键联：3′—NH—P(S)(OR)—O—5’其中R选自由以下组成的组：氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和磷酸酯保护基，或其药学上可接受的盐。22.如实施方案19-21中任一项所述的化合物活性药物成分，其中所述多核苷酸包含在10个与50个之间的与人端粒酶的所述RNA组分互补的连续核苷亚基。23.如实施方案19-22中任一项所述的化本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种组合物，其具有相对于化合物或其盐少于4重量份中1重量份的(N-1)产物，其中所述化合物包含具有10个或更多个核苷亚基的序列的多核苷酸，并且至少两个所述核苷亚基通过N3′→P5′磷酰胺酯亚基间键联连接。/n
【技术特征摘要】
20140501 US 61/987,396;20150423 US 62/151,9091.一种组合物，其具有相对于化合物或其盐少于4重量份中1重量份的(N-1)产物，其中所述化合物包含具有10个或更多个核苷亚基的序列的多核苷酸，并且至少两个所述核苷亚基通过N3′→P5′磷酰胺酯亚基间键联连接。
2.一种化合物活性药物成分，其具有少于11重量％的(N-1)产物，其中所述化合物或其药学上可接受的盐包含具有10个或更多个与人端粒酶的RNA组分互补的核苷亚基的序列的多核苷酸，其中至少两个所述核苷亚基通过N3′→P5′磷酰胺酯亚基间键联连接。
3.一种药物组合物，其包含于药...
【专利技术属性】
技术研发人员：P·H·拉米亚，
申请(专利权)人：美国杰龙生物医药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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