一种超高效液相色谱串联质谱法检测血清中5种脂溶性维生素的方法技术

本发明专利技术公开了一种超高效液相色谱串联质谱法检测血清中5种脂溶性维生素的方法，所述维生素包括VA、VD2、VD3、VE和VK1；采用超高效液相色谱串联质谱法检测预处理血清中VA、VD2、VD3、VE和VK1的含量，利用超高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，用质谱检测目标物与其对应同位素内标的质荷比(m/z)，使用同位素内标法定量，准确计算出5种脂溶性维生素的含量；本发明专利技术方法的优势是：准确度良好和重现性良好，灵敏度高、特异性强且前处理过程较简单，6min之内可完成化合物的分离和检测，基质效应、提取回收率以及精密度满足要求，可用于临床上血清中VA、VD2、VD3、VE和VK1的定量分析。

A method for the determination of five fat soluble vitamins in serum by ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

【技术实现步骤摘要】
一种超高效液相色谱串联质谱法检测血清中5种脂溶性维生素的方法
本专利技术属于分析检测
，更具体的是涉及一种超高效液相色谱串联质谱法检测血清中5种脂溶性维生素的方法。
技术介绍
维生素(Vitamin)是维持人和动物正常生理功能的重要物质，这类物质必须从食物中获得，在人类的生长发育和代谢中发挥着重要的作用。机体缺乏维生素会引起各种代谢障碍，甚至引发疾病，这类疾病被统称为维生素缺乏症。维生素分为水溶性维生素和脂溶性维生素两大类，本专利中涉及到的维生素为脂溶性维生素，包括维生素A，D，E，K1。维生素A在视网膜的功能(适应昏暗的光线)中起着至关重要的作用，是上皮组织生长和分化、骨骼生长、生殖和胚胎发育所必需的。维生素A与某些类胡萝卜素一起增强免疫功能。眼睛和皮肤的退行性变化在维生素A缺乏症中很常见。严重或长期缺乏会导致干眼症、角膜溃疡、瘢痕和失明，摄入不足还可能导致免疫力低下。过量的维生素A是有毒的，临床表现多种多样，包括皮肤干燥、唇裂、舌炎、呕吐、脱发、骨质疏松和疼痛、高钙血症、淋巴结肿大、高脂血症、闭经，以及颅内压增高、乳头水肿的大脑假瘤的特征。伴有门脉高压的肝纤维化也可能发生。孕妇服用维生素A过量可能会引起胎儿先天性畸形，如自然流产，颅面畸形，和心脏瓣膜疾病。维生素D在体内的主要存在形式为25-OH维生素D,其中25-OHVD2和25-OHVD3与健康密切相关，缺乏维生素D可能会引起儿童佝偻病，还可能会影响机体的神经、肌肉、造血及免疫等组织器官的功能。维生素E又被称为生育酚，作为抗氧化剂和自由基清除剂，保护所有细胞生物膜中不饱和脂肪的完整性，保护视黄醇(维生素A)不受氧化破坏。维生素E可以促进内皮细胞中前列环素的形成，并抑制血栓细胞中血栓烷类的形成，从而减少血栓细胞在内皮细胞表面的聚集。儿童缺乏维生素E可导致可逆的运动和感觉神经病。维生素K1又称为凝血维生素，包括K1、K2、K3、K4等几种形式，该专利中检测的为维生素K1，维生素K1在体内功能主要是促进凝血、生血，同时促进身体对钙、糖的吸收。目前，国内外有关血清和血浆中各种维生素的测定方法报道很多，测定维生素的方法有很多种，其中常见的方法有：层析法、分光光度法、气相色谱法、液相色谱法，在众多的方法中，液相色谱法或液相串联质谱法为测定维生素的首选方法，以往方法存在前处理复杂、干扰因素多、特异性差、分析时间长、灵敏度不高、定性定量准确性差且重现性较差的问题，另外目前多种脂溶性维生素共同检测的方法，多用蛋白沉淀和液液萃取两步法来做，操作略复杂，且前处理时间长，血样用量大。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中5种脂溶性维生素的方法。所述维生素包括维生素A(VA)、25-羟基维生素D2(VD2)、25-羟基维生素D3(VD3)、维生素E(VE)、维生素K1(VK1)。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种超高效液相色谱串联质谱法检测血清中5种脂溶性维生素的方法，所述维生素包括VA、VD2、VD3、VE和VK1；采用超高效液相色谱串联质谱法检测预处理血清中VA、VD2、VD3、VE和VK1的含量，利用同位素内标法定量，以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出血清中5种维生素的浓度；(1)具体色谱条件：流动相A：含0.1％甲酸的水；流动相B：含0.1％甲酸和2mmol甲酸铵的甲醇；流速为0.4mL/min，柱温为50℃，进样体积为2μL；采用梯度洗脱方式，流动相按照表1中的梯度保留时间均匀变化；表1流动相梯度洗脱参数：(2)具体质谱条件：电喷雾电离正离子模式，多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压：3.0KV；去溶剂温度：120℃；雾化气温度：550℃，雾化气流速：800L/h，锥孔气流速：150L/h；同时监测目标物维生素的对应的标准品和内标母离子、子离子、去簇电压和碰撞电压，参数见表2；表2质谱检测参数化合物母离子m/z子离子m/z去簇电压(V)碰撞电压(V)VA269.2292.811510VA-IS277.2498.104020VE431.29164.9155VE-IS437.35171.96108VD2395.23118.935025VD2-IS401.33118.934823VD3383.27106.872827VD3-IS389.3371.344413VK1451.29186.935023VK1-IS458.33194.014423优选地，所述的血清为人或动物的血清。优选地，所述的流动相B中甲酸的浓度为0.01％-0.2％，甲酸铵的浓度为0.1-10mmol。优选地，预处理血清的方法为将血清与内标工作液混合，通过萃取液一步液-液萃取获得预处理血清，所述的内标工作液为含有VA、VD2、VD3、VE和VK1对应内标的甲醇溶液。进一步优选地，所述的萃取液为甲基叔丁基醚本专利技术是将血清样本与所有待测物的内标溶液混合，通过一步液-液萃取获得待测溶液，利用超高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，用质谱检测目标物与其对应同位素内标的质荷比(m/z)，使用同位素内标法定量，准确计算出5种脂溶性维生素的含量，有益效果：本研究采用ID-UPLC-MS/MS方法测定了人体血清中的VA、VD2、VD3、VE和VK1，方法准确度良好；血清中5种维生素的批内精密度为1.78～8.13％，批间精密度分别为4.11％-9.52％，方法的重现性良好；而且灵敏度高、特异性强且使用一步液液萃取法就能完成5种维生素的一同分析，前处理过程较简单，使前处理节省一半时间，6min之内可完成化合物的分离和检测，基质效应、提取回收率以及精密度满足要求，可用于临床上血清中VA、VD2、VD3、VE和VK1的定量分析，为临床上维生素缺乏症的健康评估提供一种可靠的检测方法。附图说明图1为本专利技术中5种维生素标准品TIC谱图；图2为血清中5种维生素的TIC谱图。具体实施方式为了加深对本专利技术的理解，下面将结合实施例和附图对本专利技术作进一步详述，该实施例仅用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术保护范围的限定。实施例11.材料(1)方法学研究本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超高效液相色谱串联质谱法检测血清中5种脂溶性维生素的方法，其特征在于，所述维生素包括VA、VD2、VD3、VE和VK1；/n采用超高效液相色谱串联质谱法检测预处理血清中VA、VD2、VD3、VE和VK1的含量，利用同位素内标法定量，以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出血清中5种维生素的浓度；/n(1)具体色谱条件：流动相A：含0.1％甲酸的水；流动相B：含0.1％甲酸和2mmol甲酸铵的甲醇；流速为0.4mL/min，柱温为50℃，进样体积为2μL；采用梯度洗脱方式，流动相按照表1中的梯度保留时间均匀变化；/n表1流动相梯度洗脱参数：/n

【技术特征摘要】
1.一种超高效液相色谱串联质谱法检测血清中5种脂溶性维生素的方法，其特征在于，所述维生素包括VA、VD2、VD3、VE和VK1；
采用超高效液相色谱串联质谱法检测预处理血清中VA、VD2、VD3、VE和VK1的含量，利用同位素内标法定量，以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出血清中5种维生素的浓度；
(1)具体色谱条件：流动相A：含0.1％甲酸的水；流动相B：含0.1％甲酸和2mmol甲酸铵的甲醇；流速为0.4mL/min，柱温为50℃，进样体积为2μL；采用梯度洗脱方式，流动相按照表1中的梯度保留时间均匀变化；
表1流动相梯度洗脱参数：



(2)具体质谱条件：电喷雾电离正离子模式，多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压：3.0KV；去溶剂温度：120℃；雾化气温度：550℃，雾化气流速：800L/h，锥孔气流速：150L/h；同时监测目标物维生素的对应的标准品和内标母离子、子离子、去簇电压和碰撞电压，参数见表2；
表2质谱检测参数











化合物
母离子m/z
子离子m/z
去簇电压(V)
碰撞电压(V)


VA
269.22
92.81
15
10


VA-IS
277.24
98.10
40
20


VE
431.29
164.91
5
5


VE-IS
437.35

【专利技术属性】
技术研发人员：成晓亮，李美娟，
申请(专利权)人：南京品生医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32