【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于排泄物检测，具体涉及一种高效液相色谱串联质谱测定人粪便中维生素b类化合物的方法，其中，维生素b类化合物分别为：硫胺素(vb1)、核黄素(vb2)、烟酸(vb3)、泛酸(vb5)、吡哆酸(pa)、吡哆醇(pn)、生物素(vb7)、5-甲基四氢叶酸(5-mthf)、叶酸(vb9)和甲基丙二酸(mma)。
技术介绍
1、维生素b类化合物是人体必需的维生素，在人体生长、发育、代谢中起着重要的作用。本技术所检测的各种化合物，硫胺素为维生素b1；核黄素为维生素b2；烟酸为维生素b3；泛酸为维生素b5；吡哆醇为维生素b6；吡哆酸为维生素b6的代谢产物；生物素为维生素b7；叶酸为维生素b9；5-甲基四氢叶酸为维生素b9在体内的活性形式；甲基丙二酸为维生素b12的反向标志物，当人体维生素b12缺乏时，体内甲基丙二酸水平会升高。
2、必须维生素不能由人体自行合成，必须从外部获取。最主要的获取途径为日常饮食。但是人体口服摄入的维生素基本上在小肠内就被完全，基本不能抵达大肠。人类粪便中的维生素b类化合物主要来自于肠道菌群而不是日常摄入。相反，肠道菌群分泌的b类维生素可以被人体吸收利用。根据一项研究，肠道菌群的最多可提供的各b类维生素占人体每日需要量的比例为：b1：2.3％；b2：2.8％；b3：27％；b5：0.0078％；b6：86％；b7：4.5％；b9：37％；b12：31％。因此，肠道菌群的状况对于人体的b类维生素摄入量有重要的影响。通过对人类粪便中的维生素b类化合物进行定量检测，有助于了解肠道菌群的生长情况以及宿主的
3、目前维生素b类化合物的常用检测手段主要为免疫法、电化学法、荧光法等技术，但是这些方法的特异性较差，较容易受到各种来源的干扰，样本检测的重复性较差，而且免疫法也很难实现多种化合物的同时测定。高效液相色谱串联质谱法是通过各种化合物的分子结构特征差异，在高效液相系统中实现目标化合物与其干扰成分的初步分离，然后依靠极性、质荷比及其结构所包含的特征碎片的不同将目标化合物与其干扰成分进行进一步区分，最终实现精准定量的一项技术。相较于免疫法、电化学法、荧光法等技术，高效液相色谱串联质谱法具有更高的灵敏度、精密度和准确度。
4、作为检测对象，粪便与其他常规的维生素b类化合物检测样本也有较大的区别。在血清、血浆、乳汁、尿液、唾液等液体样本中，维生素b类化合物在同相介质中基本是均匀分布。而粪便中除包含大量水分之外，还包括未消化的食物残渣、消化液残余、消化道脱落的细胞以及大量的消化道细菌。在这样的异相介质中，维生素b类化合物的分布较为复杂，不能直接取一定量的样本进行检测。
5、考虑到上面提及的检测手段和检测对象问题，目前虽然有检测人类粪便中个别维生素种类以及检测非人类粪便样本中多种维生素b类化合物的方法报道，但尚未有同时检测人类粪便中多种维生素b类化合物的文献报道。
6、陈一波、易宏波等人检测了猪肠道内容物/粪便中b族维生素含量(专利公布号cn112129845 a)。该方法使用uplc-ms/ms系统，前处理为猪盲肠内容物/粪便加甲醇/乙腈/水(2:2:1)进行匀浆，离心取上清后使用ostro磷脂去除板进行净化，滤液经氮气吹干后复溶，离心取上清液注入液质联用系统进行检测。此外，在该方法中使用了成本较高的uplc色谱柱作为液相色谱分离方法，对仪器压力承受能力要求较高，普通hplc系统不能适用。同时，由于前处理使用了ostro磷脂去除板，进行净化，检测的设备成本和耗材成本较传统方法偏高。前处理采用spe再氮吹复溶，过程复杂，无论是耗材成本还是时间成本，都较高。另外该专利中未能检测维生素b9的主要代谢物5-甲基四氢叶酸，且使用外标法进行定量，外标法由于准确性和重复性差，在生物定量分析领域已被淘汰。因此目前亟需一种简单、快速、准确、可靠，可以同时测定人类粪便中各种维生素b类化合物且仪器和试剂耗材成本相对较低的测定方法，以帮助临床医学工作者研究人类粪便中各种维生素b类化合物的含量和含量变化趋势，以及它们和肠道菌群、人体健康与各种疾病的相关性。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是在现有技术的基础上，提供一种高效液相色谱串联质谱测定人粪便中维生素b类化合物的方法。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种高效液相色谱串联质谱测定人粪便中维生素b类化合物的方法，其包括以下步骤：取人类粪便为待测样本，经过匀浆沉淀的前处理后，利用高效液相色谱将目标待测物与样本基质中的干扰组分进行分离，再通过质谱仪检测目标待测物维生素b类化合物与其对应同位素内标物的质荷比的响应，使用同位素内标法定量，分别计算出各种维生素b类化合物的含量，其中维生素b类化合物包括硫胺素(vb1)、核黄素(vb2)、烟酸(vb3)、泛酸(vb5)和叶酸(vb9)。
4、本方法中的前处理可以包括以下步骤：取待测样本，加入匀浆剂后制备出待测样本匀浆液，再加入混合内标工作液和蛋白质沉淀剂制备进样液。
5、在一种具体方案中，前处理包括以下步骤：取待测粪便样本，加入匀浆剂，震摇，超声，离心，取上清液作为待测样本匀浆液；向待测样本匀浆液中加混合内标工作液和蛋白质沉淀剂，振荡离心后取上清液待进样。
6、本专利技术中的匀浆剂可采用抗坏血酸水溶液，优选为1％～20％抗坏血酸水溶液，更优选为10％抗坏血酸水溶液。
7、本专利技术前处理中的匀浆剂的加入量为样本质量的3-15倍，优选4-12倍，更优选4-9倍；实验发现，过低或过高的匀浆剂加入量会严重影响本方法的检测结果的准确性。
8、本专利技术中的蛋白质沉淀剂可采用甲醇-乙腈混合溶液，优选为体积比为1～4:1的甲醇-乙腈混合溶液，更优选为体积比为1～2:1的甲醇-乙腈混合溶液。
9、本专利技术中的维生素b类化合物包括硫胺素(vb1)、核黄素(vb2)、烟酸(vb3)、泛酸(vb5)、吡哆酸(pa)、吡哆醇(pn)、生物素(vb7)、5-甲基四氢叶酸(5-mthf)、叶酸(vb9)和甲基丙二酸(mma)中的多种，即按本申请的方法可以准确测定人粪便中任意一种或多种的组合的具体含量。在一种优选方案中，维生素b类化合物为硫胺素(vb1)、核黄素(vb2)、烟酸(vb3)、泛酸(vb5)、吡哆酸(pa)、吡哆醇(pn)、生物素(vb7)、5-甲基四氢叶酸(5-mthf)、叶酸(vb9)和甲基丙二酸(mma)这10种，即本申请可以同时准确测定人粪便中这10种维生素b类化合物的具体含量。
10、本申请中所指出的维生素b类化合物对应同位素内标物包括硫胺素-13c4(vb1-is)、核黄素-13c4,15n2(vb2-is)、烟酸-d4(vb3-is)、泛酸-13c3,15n(vb5-is)、吡哆酸-d3(pa-is)、吡哆醇-13c4(pn-is)、生物素-d4(vb7-is)、5-甲基四氢叶酸-d4(5-mthf-is)、叶酸-d4(vb9-is)和基丙二酸-d3(mma-is)中的多种。在一种优选方案中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效液相色谱串联质谱测定人粪便中维生素B类化合物的方法，其特征在于包括以下步骤：取人类粪便为待测样本，经过匀浆沉淀的前处理后，利用高效液相色谱将目标待测物与样本基质中的干扰组分进行分离，再通过质谱仪检测目标待测物维生素B类化合物与其对应同位素内标物的质荷比的响应，使用同位素内标法定量，分别计算出各种维生素B类化合物的含量，所述维生素B类化合物包括硫胺素(VB1)、核黄素(VB2)、烟酸(VB3)、泛酸(VB5)和叶酸(VB9)。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测定人粪便中维生素B类化合物的方法，其特征在于所述前处理包括以下步骤：取待测样本，加入匀浆剂后制备出待测样本匀浆液，再加入混合内标工作液和蛋白质沉淀剂制备进样液。
3.根据权利要求1或2所述的高效液相色谱串联质谱测定人粪便中维生素B类化合物的方法，其特征在于所述前处理包括以下步骤：取待测粪便样本，加入匀浆剂，震摇，超声，离心，取上清液作为待测样本匀浆液；向待测样本匀浆液中加混合内标工作液和蛋白质沉淀剂，振荡离心后取上清液待进样；所述匀浆剂为抗坏血酸水溶液，优选为1％～20％抗坏血
4.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测定人粪便中维生素B类化合物的方法，其特征在于所述维生素B类化合物包括硫胺素(VB1)、核黄素(VB2)、烟酸(VB3)、泛酸(VB5)、吡哆酸(PA)、吡哆醇(PN)、生物素(VB7)、5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)、叶酸(VB9)和甲基丙二酸(MMA)中的多种，所述维生素B类化合物对应同位素内标物包括硫胺素-13C4(VB1-IS)、核黄素-13C4,15N2(VB2-IS)、烟酸-d4(VB3-IS)、泛酸-13C3,15N(VB5-IS)、吡哆酸-d3(PA-IS)、吡哆醇-13C4(PN-IS)、生物素-d4(VB7-IS)、5-甲基四氢叶酸-d4(5-MTHF-IS)、叶酸-d4(VB9-IS)和基丙二酸-d3(MMA-IS)中的多种；优选的，所述维生素B类化合物为硫胺素(VB1)、核黄素(VB2)、烟酸(VB3)、泛酸(VB5)、吡哆酸(PA)、吡哆醇(PN)、生物素(VB7)、5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)、叶酸(VB9)和甲基丙二酸(MMA)；所述维生素B类化合物对应同位素内标物为硫胺素-13C4(VB1-IS)、核黄素-13C4,15N2(VB2-IS)、烟酸-d4(VB3-IS)、泛酸-13C3,15N(VB5-IS)、吡哆酸-d3(PA-IS)、吡哆醇-13C4(PN-IS)、生物素-d4(VB7-IS)、5-甲基四氢叶酸-d4(5-MTHF-IS)、叶酸-d4(VB9-IS)和基丙二酸-d3(MMA-IS)。
5.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测定人粪便中维生素B类化合物的方法，其特征在于高效液相色谱条件包括：
6.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测定人粪便中维生素B类化合物的方法，其特征在于质谱条件包括：在电喷雾电离模式下，采用多反应监测进行正离子和负离子模式扫描；毛细管电压为2.0kV(正离子)和3.5kV(负离子)，喷嘴电压为200V(正离子)和300V(负离子)；干燥气温度为300℃，鞘气温度为350℃，干燥气流速为10L/min，鞘气流速为11L/min，雾化气压力45psi；同时监测各种维生素B类化合物与对应同位素内标。
7.根据权利要求2或3所述的高效液相色谱串联质谱测定人粪便中维生素B类化合物的方法，其特征在于所述混合内标工作液的配置方法为：取维生素B类化合物对应同位素内标物，分别加入甲醇水溶液完全溶解，配制成同位素储备液；所述同位素储备液再以甲醇水溶液配制成包含有多种同位素内标物的同位素混合内标SI溶液；取所述混合内标SI溶液，加入甲醇，混合均匀得混合内标工作液。
8.根据权利要求7所述的高效液相色谱串联质谱测定人粪便中维生素B类化合物的方法，其特征在于所述混合内标工作液按如下方法制备：
9.根据权利要求5所述的高效液相色谱串联质谱测定人粪便中维生素B类化合物的方法，其特征在于所述流动相A为0.1～0.15％甲酸-水溶液，优选为0.1％甲酸-水溶液；所述流动相B为0.1～0.15％甲酸-甲醇，优选为0.1％甲酸-甲醇。
10.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测定人粪便中维生素B类化合物的方法，其特征在于所述色谱柱的长度为1...
【技术特征摘要】
1.一种高效液相色谱串联质谱测定人粪便中维生素b类化合物的方法，其特征在于包括以下步骤：取人类粪便为待测样本，经过匀浆沉淀的前处理后，利用高效液相色谱将目标待测物与样本基质中的干扰组分进行分离，再通过质谱仪检测目标待测物维生素b类化合物与其对应同位素内标物的质荷比的响应，使用同位素内标法定量，分别计算出各种维生素b类化合物的含量，所述维生素b类化合物包括硫胺素(vb1)、核黄素(vb2)、烟酸(vb3)、泛酸(vb5)和叶酸(vb9)。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测定人粪便中维生素b类化合物的方法，其特征在于所述前处理包括以下步骤：取待测样本，加入匀浆剂后制备出待测样本匀浆液，再加入混合内标工作液和蛋白质沉淀剂制备进样液。
3.根据权利要求1或2所述的高效液相色谱串联质谱测定人粪便中维生素b类化合物的方法，其特征在于所述前处理包括以下步骤：取待测粪便样本，加入匀浆剂，震摇，超声，离心，取上清液作为待测样本匀浆液；向待测样本匀浆液中加混合内标工作液和蛋白质沉淀剂，振荡离心后取上清液待进样；所述匀浆剂为抗坏血酸水溶液，优选为1％～20％抗坏血酸水溶液，更优选为10％抗坏血酸水溶液；所述匀浆剂的加入量为样本质量的3-15倍，优选4-9倍；所述蛋白质沉淀剂为甲醇-乙腈混合溶液，优选为体积比为1～4:1的甲醇-乙腈混合溶液，更优选为体积比为1～2:1的甲醇-乙腈混合溶液。
4.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测定人粪便中维生素b类化合物的方法，其特征在于所述维生素b类化合物包括硫胺素(vb1)、核黄素(vb2)、烟酸(vb3)、泛酸(vb5)、吡哆酸(pa)、吡哆醇(pn)、生物素(vb7)、5-甲基四氢叶酸(5-mthf)、叶酸(vb9)和甲基丙二酸(mma)中的多种，所述维生素b类化合物对应同位素内标物包括硫胺素-13c4(vb1-is)、核黄素-13c4,15n2(vb2-is)、烟酸-d4(vb3-is)、泛酸-13c3,15n(vb5-is)、吡哆酸-d3(pa-is)、吡哆醇-13c4(pn-is)、生物素-d4(vb7-is)、5-甲基四氢叶酸-d4(5-mthf-is)、叶酸-d4(vb9-is)和基丙二酸-d3(mma-is)中的多种；优选的，所述维生素b类化合物为硫胺素(vb1)、核黄素(vb2)、烟酸(vb3)、泛酸(vb5)、吡哆酸(pa)、吡哆醇(pn)、生物素(vb7)、5-...
【专利技术属性】
技术研发人员：成晓亮，张伟，夏宇，盛蔚，原晓盈，李美娟，
申请(专利权)人：南京品生医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：
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