一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中ADMA和SDMA的方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及血液检测技术领域，特别是涉及一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中ADMA和SDMA的方法，包括：步骤一、将血浆处理后取上清液进样，经过超高效液相色谱将ADMA和SDMA与血浆基质分离；步骤二、将超高效液相色谱分离的ADMA和SDMA再通过串联质谱进行检测，根据建立的校准曲线计算ADMA和SDMA的含量。本发明专利技术解决现有技术中没有共同检测ADMA和SDMA含量的检测方法的问题。本发明专利技术具有灵敏度高、特异性强、结果准确且前处理过程较简单的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中ADMA和SDMA的方法及试剂盒
本专利技术涉及血液检测
，特别是涉及一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中ADMA和SDMA的方法及试剂盒。
技术介绍
一氧化氮(NO)是内皮衍生的血管活性物质之一，对于维持内皮稳态起了重要作用，低水平的NO与内皮功能受损有关。非对称二甲基精氨酸(ADMA)和对称二甲基精氨酸(SDMA)是L-精氨酸的代谢产物。正常情况下，精氨酸被血管内皮细胞内源性一氧化氮合成酶转化成一氧化氮和L-瓜氨酸。ADMA可以竞争性的抑制一氧化氮合成酶的功能，从而减少一氧化氮的产量，SDMA通过减少细胞中的精氨酸间接影响一氧化氮产生。最终，因一氧化氮缺乏，血管内皮细胞功能不全，导致血管动脉粥样硬化。因此，人体ADMA和SDMA含量的升高或者降低与心脑血管类疾病风险息息相关，其在血浆中含量的高低对于评估人体健康是至关重要的。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中ADMA和SDMA的方法，用于解决现有技术中没有共同检测ADMA和SDMA含量的检测方法的问题，本专利技术还提供一种用于ADMA和SDMA定量分析的试剂盒。本专利技术具有灵敏度高、特异性强、结果准确且前处理过程较简单的优点。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面，提供一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中ADMA和SDMA的方法，包括如下步骤：步骤一、将血浆处理后取上清液进样，经过超高效液相色谱将ADMA和SDMA与血浆基质分离，其中色谱条件如下：色谱柱为三键键合式烷基柱，色谱柱柱温为30～50℃，进样量为0.5～5μL，流速为0.1～1mL/min，流动相A为0.2mM甲酸铵和体积分数0.004％甲酸的水溶液，流动相B为乙腈；步骤二、将超高效液相色谱分离的ADMA和SDMA再通过串联质谱进行检测，根据建立的校准曲线计算ADMA和SDMA的含量，其中质谱条件如下：喷雾电压2.5～3.5kV，去溶剂温度为80～140℃，雾化气温度为350～450℃，雾化气流速为700～900L/h，锥孔气流速为120～180L/h。超高效液相色谱串联质谱检测血浆中ADMA和SDMA的方法具有灵敏度高、特异性强、结果准确且前处理过程较简单的优点，6min之内完成待测物的分离和检测，基质效应与精密度基本满足要求，可用于临床上ADMA和SDMA的定量分析，为临床上心脑血管疾病的健康评估提供一种可靠的检测方法。采用ID-UPLC-MS/MS方法测定了人体血浆中的非对称二甲基精氨酸(ADMA)和对称二甲基精氨酸(SDMA)。同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。于本专利技术的一实施例中，所述步骤一中血浆处理的具体过程为：将血浆和内标液B按照体积比为1：(50～80)加入离心管中，先涡旋10～30s、振荡8～10min后进行离心，离心速率为12000～18000r/min，离心时间为8～12min，离心后取上清液作为待测样。于本专利技术的一实施例中，所述血浆和内标液B按照体积比为1：60，离心速率为15000r/min，离心时间为10min。于本专利技术的一实施例中，所述的血浆为人或动物的血浆。于本专利技术的一实施例中，所述内标液B的制备过程为：取同位素内标品ADMA-d7加入体积分数为50％的甲醇水溶液中溶解，得到摩尔浓度为10mM的同位素内标溶液，再用体积分数为50％的甲醇水溶液将该同位素内标溶液稀释至摩尔浓度为40μM的内标液A，将内标液A和甲醇按照体积比为1：2000混合即得内标液B。于本专利技术的一实施例中，所述色谱条件如下：色谱柱为ACQUITYUPLCBEHAmide，2.1×100mm，1.7μm；色谱柱柱温为40℃；进样量为1μL；流速为0.4mL/min；流动相梯度洗脱参数如表2所示：表格2时间流速(mL/min)流动相A/％流动相B/％0.00.415853.00.470303.50.470306.00.41585，其中流动相A为0.2mM甲酸铵和体积分数0.004％甲酸的水溶液，流动相B为乙腈。于本专利技术的一实施例中，所述校准曲线的制作过程为：将含ADMA和SDMA各0.1mM的标准品储备液与空白血浆基质溶液按照体积比为1：19混合后作为第一个高值浓度点，其摩尔浓度为5μM；再将第一个高值浓度点的溶液与空白血浆基质溶液按照体积比为1：1混合后作为第二高值浓度点，其摩尔浓度为2.5μM；再将第二高值浓度点的溶液与空白血浆基质溶液逐级稀释得到其余六个校准点；再将8个浓度点的溶液分别与内标液B按照体积比为1：60加入离心管中，先涡旋10～30s、振荡8～10min后进行离心，再分别取上清液进样，通过串联质谱进行检测，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，即可。于本专利技术的一实施例中，所述空白血浆基质溶液为50mg/mL牛血清白蛋白水溶液。于本专利技术的一实施例中，所述质谱条件如下：喷雾电压3.0kV；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为400℃；雾化气流速为800L/h；锥孔气流速为150L/h；同时监测了目标物ADMA(m/z203.1→46.0)、SDMA(m/z203.1→172.0)以及同位素内标ADMA-d7(m/z210.1→46.0)，各个目标物的去簇电压和碰撞电压参数见表3：表格3本专利技术第二方面，提供一种用于ADMA和SDMA定量分析的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：0.2mM甲酸铵和体积分数0.004％甲酸的水溶液、乙腈、含ADMA和SDMA各0.1mM的体积分数50％甲醇溶液、50mg/mL牛血清白蛋白的水溶液、甲醇、含ADMA和SDMA各0.1μM的空白血浆基质溶液、含ADMA和SDMA各0.5μM的空白血浆基质溶液、含ADMA和SDMA各4μM的空白血浆基质溶液。于本专利技术的一实施例中，所述试剂盒中包括：500mL的0.2mM甲酸铵和体积分数0.004％甲酸的水溶液、500mL的乙腈、0.1mL的含ADMA和SDMA各0.1mM的体积分数50％甲醇溶液、20mL的50mg/mL牛血清白蛋白的水溶液、100mL的甲醇、0.5mL的含ADMA和SDMA各0.1μM的空白血浆基质溶液、0.5mL的含ADMA和SDMA各0.5μM的空白血浆基质溶液、0.5mL的含ADMA和SDMA各4μM的空白血浆基质溶液。如上所述，本专利技术的一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中ADMA和SDMA的方法，具有以下有益本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中ADMA和SDMA的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤一、将血浆处理后取上清液进样，经过超高效液相色谱将ADMA和SDMA与血浆基质分离，其中色谱条件如下：色谱柱为三键键合式烷基柱，色谱柱柱温为30～50℃，进样量为0.5～5μL，流速为0.1～1mL/min，流动相A为0.2mM甲酸铵和体积分数0.004％甲酸的水溶液，流动相B为乙腈；/n步骤二、将超高效液相色谱分离的ADMA和SDMA再通过串联质谱进行检测，根据建立的校准曲线计算ADMA和SDMA的含量，其中质谱条件如下：喷雾电压2.5～3.5kV，去溶剂温度为80～140℃，雾化气温度为350～450℃，雾化气流速为700～900L/h，锥孔气流速为120～180L/h。/n

【技术特征摘要】
1.一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中ADMA和SDMA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、将血浆处理后取上清液进样，经过超高效液相色谱将ADMA和SDMA与血浆基质分离，其中色谱条件如下：色谱柱为三键键合式烷基柱，色谱柱柱温为30～50℃，进样量为0.5～5μL，流速为0.1～1mL/min，流动相A为0.2mM甲酸铵和体积分数0.004％甲酸的水溶液，流动相B为乙腈；
步骤二、将超高效液相色谱分离的ADMA和SDMA再通过串联质谱进行检测，根据建立的校准曲线计算ADMA和SDMA的含量，其中质谱条件如下：喷雾电压2.5～3.5kV，去溶剂温度为80～140℃，雾化气温度为350～450℃，雾化气流速为700～900L/h，锥孔气流速为120～180L/h。


2.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中ADMA和SDMA的方法，其特征在于，所述步骤一中血浆处理的具体过程为：将血浆和内标液B按照体积比为1：(50～80)加入离心管中，先涡旋10～30s、振荡8～10min后进行离心，离心速率为12000～18000r/min，离心时间为8～12min，离心后取上清液作为待测样。


3.根据权利要求2所述的一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中ADMA和SDMA的方法，其特征在于：所述血浆和内标液B按照体积比为1：60，离心速率为15000r/min，离心时间为10min。


4.根据权利要求2或3所述的一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中ADMA和SDMA的方法，其特征在于，所述内标液B的制备过程为：取同位素内标品ADMA-d7加入体积分数为50％的甲醇水溶液中溶解，得到摩尔浓度为10mM的同位素内标溶液，再用体积分数为50％的甲醇水溶液将该同位素内标溶液稀释至摩尔浓度为40μM的内标液A，将内标液A和甲醇按照体积比为1：2000混合即得内标液B。


5.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中ADMA和SDMA的方法，其特征在于，所述色谱条件如下：色谱柱为ACQUITYUPLCBEHAmide，2.1×100mm，1.7μm；色谱柱柱温为40℃；进样量为1μL；流速为0.4mL/min；流动相梯度洗脱参数如表1所示：
表格1




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其中流动相A为0.2mM甲酸铵和体积分数0.004％甲酸的水...

【专利技术属性】
技术研发人员：成晓亮，李美娟，郑可嘉，张伟，
申请(专利权)人：南京品生医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32