本发明专利技术公开了一种检测血浆中13种神经酰胺的液质联用方法，包括以下步骤：(1)血浆样品的预处理：向血浆样品中加入混合内标液，再经振荡、离心，取上清液，即得待检测血浆样品；(2)定性和定量检测：采用超高效液相色谱技术将待检测血浆样品中13种神经酰胺进行分离，再利用质谱同位素内标定量法通过比对样品中保留时间、质谱信息，检测样品中是否含有13种神经酰胺，并以分别含有上述13种神经酰胺的溶液作为标准品，对待检测血浆样品中每一种神经酰胺成分进行定量检测。该方法检测灵敏度高、特异性强、准确且血浆样品前处理过程较简单，7min之内可完成多种神经酰胺的分离和检测，基质效应和精密度满足要求。
【技术实现步骤摘要】
一种检测血浆中13种神经酰胺的液质联用方法
本专利技术涉及生物化学分析检测
，具体涉及一种检测血浆中13种神经酰胺的液质联用方法。
技术介绍
神经酰胺是脂类家族中非常重要的一组代谢分子，存在于包括低密度脂蛋白的所有脂蛋白中。神经酰胺有很高的生物活性，可影响许多生物过程，如细胞膜结构、细胞应激发病以及细胞凋亡等，它是饱和脂肪酸和鞘氨醇的代谢产物，代谢功能异常和血脂异常的病理状态下，神经酰胺未被脂肪吸收而蓄积在组织中。血浆中神经酰胺浓度不仅可以提示心血管类疾病风险，如高血压、心衰、二型糖尿病等，也对动脉粥样硬化斑块活性有提示作用。神经酰胺按照脂肪酸链长度的不同，至少可分为50种类型，近年来欧美顶级研究机构发现三种特有的神经酰胺分子Cer(16:0)、Cer(18:0)和Cer(24:0)，他们与心血管疾病发生高度相关，此后围绕关于神经酰胺作为心血管疾病发生发展方面的机制研究层出不穷。多项已发表的研究已验证了神经酰胺对心血管风险预后的预测价值，血浆神经酰胺预测的风险与传统因子(包括年龄、性别、体重指数、吸烟状态和血液胆固醇)无关。另外对于在其他标志物，比如C反应蛋白(CRP)、apoB和Lp-PLA2进行校正后，神经酰胺的预测价值仍很明显。梅奥诊断的Jeffrey医生在对接受侵入性治疗的ACS患者进行了多中心回顾性研究(n＝1637)，研究者测定患者基线时的血浆神经酰胺浓度，并对其随访1年，在随访过程中出现心血管相关死亡的51例患者中，血浆神经酰胺浓度显著升高，对之前出现的心肌梗死、糖尿病、胆固醇、HDL-C、LDL-C和GRACE评分进行校正后，神经酰胺的预测能力仍显著。结合3种预测性的血浆神经酰胺及其与第4种神经酰胺的比值，Jeffrey医生团队构建了一套神经酰胺评分系统，并在此后的2项大型观察性研究(每项研究＞1500例患者)中使用神经酰胺风险评分系统，结果均表明，与得分≤2分的患者相比，得分10-12分的患者出现时间的风险增加6倍，显示出神经酰胺评分系统精准的预测能力。总之，人体神经酰胺浓度的升高或者降低与心血管类疾病风险息息相关，其在血浆中含量的高低对于评估人体健康是至关重要的。本专利技术采用高效液相色谱(HPLC)串联质谱分析技术对血浆中与心血管类疾病风险高度相关的13种神经酰胺类物质的含量进行检测分析，大大提高了检测效率和准确性。
技术实现思路
为了实现上述目的，本专利技术提供一种检测血浆中13种神经酰胺的液质联用方法，该方法检测灵敏度高、特异性强、准确且血浆样品前处理过程较简单，7min之内可完成多种神经酰胺的分离和检测，基质效应和精密度满足要求。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供一种检测血浆中13种神经酰胺的液质联用方法，采用超高效液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)对血浆中神经酰胺成分含量检测分析，所述的13种神经酰胺为C16(d18:1/16:0)、C18(d18:1/18:0)、C24(d18:1/24:0)、C24:1(d18:1/24:1(15Z))、C14(d18:1/14:0)、C18:1(d18:1/18:1(9Z))、C20(d18:1/20:0)、C22(d18:1/22:0)、C16(d18:0/16:0)、C18(d18:0/18:0)、C24(d18:0/24:0)、C24:1(d18:0/24:1(15Z))和C24:1Lactosyl(β)Ceramide(d18:1/24:1)，所述方法包括以下步骤：(1)血浆样品的预处理：向血浆样品中加入混合内标液，再经振荡、离心，取上清液，即得待检测血浆样品；(2)定性和定量检测：采用超高效液相色谱技术将待检测血浆样品中13种神经酰胺进行分离，再利用质谱同位素内标定量法通过比对样品中保留时间、质谱信息，检测样品中是否含有13种神经酰胺，并以分别含有上述13种神经酰胺的溶液作为标准品，对待检测血浆样品中每一种神经酰胺成分进行定量检测；其中，超高效液相色谱条件为：色谱柱的流速为0.3-0.5mL/min，色谱柱的柱温为30-50℃，色谱柱的进样体积为0.5-2μL，色谱流动相包括流动相A和流动相B，采用流动相梯度洗脱的方式；质谱条件为：离子源为电喷雾离子源或钠喷离子源，扫描模式为多反应监测的正离子扫描模式，喷雾电压为1-2kV，去溶剂温度为100-150℃，雾化气温度为380-450℃，雾化气流速为760-820L/h，锥孔气流速为130-160L/h，图谱数据采集的质荷比范围为50-1000m/z，采集的扫描频率为0.2-0.3s。优选地，超高效液相色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱，色谱柱规格为：长度100mm，内径2.1mm，颗粒直径为1.7μm，色谱柱的流速为0.4mL/min，色谱柱的柱温为40℃，色谱柱的进样体积为1μL。优选地，色谱流动相中流动相A为含体积分数0.1％甲酸、1mM/L甲酸铵的水，色谱流动相中流动相B为含体积分数0.1％甲酸、0.2mM/L甲酸铵的乙腈-异丙醇混合液，乙腈-异丙醇混合液中乙腈-异丙醇的体积比为4:3；色谱柱的梯度洗脱条件为：0-0.5min流动相B体积分数为85％，0.5-4.2min流动相B体积分数为99％，4.2-6.5min流动相B体积分数为85％。优选地，质谱条件为：离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为1.5kV，去溶剂温度为120℃，雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h。优选地，血浆样品的预处理过程为：取血浆样品50μL加入至离心管内，再向其中加入800μL的混合内标液，经过漩涡震荡，然后经离心后留上清液，即得待检测血浆样品待用。优选地，所述血浆样品为人或动物的血浆。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术方法灵敏度高、特异性强、准确且血浆样品前处理过程较简单，7min之内可完成多种神经酰胺组分的分离和检测，基质效应与精密度满足要求，可用于临床上神经酰胺的定性和定量分析，为临床上心血管疾病的健康评估提供一种可靠的检测方法。附图说明下面结合附图与具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。图1为实施例中标准品中13种神经酰胺及4种同位素内标物的总离子流色谱图；图2为实施例中血浆样品中13种神经酰胺及其4种同位素内标物的总离子流色谱图。具体实施方式下面通过具体实施方式来进一步说明本专利技术的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本专利技术，不应视为对本专利技术的具体限制。本专利技术中所采用的血浆样品来自于武汉亚洲心脏病医院2017年12月份门诊的血浆样本。本专利技术中所用的仪器包括XevoTQ-S三重四级杆质谱仪(WatersCorporation)；UPLCI-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，WatersCorporation)；色谱柱为WatersBEHC18色谱柱(WatersCorporation)。本专利技术中试剂耗材包括色谱纯异丙醇(Honeywell本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测血浆中13种神经酰胺的液质联用方法，采用超高效液相色谱串联质谱技术对血浆中神经酰胺成分含量检测分析，其特征在于，所述的13种神经酰胺为C16(d18:1/16:0)、C18(d18:1/18:0)、C24(d18:1/24:0)、C24:1(d18:1/24:1(15Z))、C14(d18:1/14:0)、C18:1(d18:1/18:1(9Z))、C20(d18:1/20:0)、C22(d18:1/22:0)、C16(d18:0/16:0)、C18(d18:0/18:0)、C24(d18:0/24:0)、C24:1(d18:0/24:1(15Z))和C24:1Lactosyl(β)Ceramide(d18:1/24:1)，所述方法包括以下步骤：/n(1)血浆样品的预处理：向血浆样品中加入混合内标液，再经振荡、离心，取上清液，即得待检测血浆样品；/n(2)定性和定量检测：采用超高效液相色谱技术将待检测血浆样品中13种神经酰胺进行分离，再利用质谱同位素内标定量法通过比对样品中保留时间、质谱信息，检测样品中是否含有13种神经酰胺，并以分别含有上述13种神经酰胺的溶液作为标准品，对待检测血浆样品中每一种神经酰胺成分进行定量检测；/n其中，超高效液相色谱条件为：色谱柱的流速为0.3-0.5mL/min，色谱柱的柱温为30-50℃，色谱柱的进样体积为0.5-2μL，色谱流动相包括流动相A和流动相B，采用流动相梯度洗脱的方式；/n质谱条件为：离子源为电喷雾离子源或钠喷离子源，扫描模式为多反应监测的正离子扫描模式，喷雾电压为1-2kV，去溶剂温度为100-150℃，雾化气温度为380-450℃，雾化气流速为760-820L/h，锥孔气流速为130-160L/h，图谱数据采集的质荷比范围为50-1000m/z，采集的扫描频率为0.2-0.3s。/n...
【技术特征摘要】
1.一种检测血浆中13种神经酰胺的液质联用方法，采用超高效液相色谱串联质谱技术对血浆中神经酰胺成分含量检测分析，其特征在于，所述的13种神经酰胺为C16(d18:1/16:0)、C18(d18:1/18:0)、C24(d18:1/24:0)、C24:1(d18:1/24:1(15Z))、C14(d18:1/14:0)、C18:1(d18:1/18:1(9Z))、C20(d18:1/20:0)、C22(d18:1/22:0)、C16(d18:0/16:0)、C18(d18:0/18:0)、C24(d18:0/24:0)、C24:1(d18:0/24:1(15Z))和C24:1Lactosyl(β)Ceramide(d18:1/24:1)，所述方法包括以下步骤：
(1)血浆样品的预处理：向血浆样品中加入混合内标液，再经振荡、离心，取上清液，即得待检测血浆样品；
(2)定性和定量检测：采用超高效液相色谱技术将待检测血浆样品中13种神经酰胺进行分离，再利用质谱同位素内标定量法通过比对样品中保留时间、质谱信息，检测样品中是否含有13种神经酰胺，并以分别含有上述13种神经酰胺的溶液作为标准品，对待检测血浆样品中每一种神经酰胺成分进行定量检测；
其中，超高效液相色谱条件为：色谱柱的流速为0.3-0.5mL/min，色谱柱的柱温为30-50℃，色谱柱的进样体积为0.5-2μL，色谱流动相包括流动相A和流动相B，采用流动相梯度洗脱的方式；
质谱条件为：离子源为电喷雾离子源或钠喷离子源，扫描模式为多反应监测的正离子扫描模式，喷雾电压为1-2kV，去溶剂温度为100-150℃，雾化气温度为380-450℃，雾化气流速为760-820L/h，锥孔气流速为130-160L...
【专利技术属性】
技术研发人员：成晓亮，李美娟，郑可嘉，张伟，
申请(专利权)人：南京品生医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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