一种富硒植物干粉中硒形态测定的方法技术

本发明专利技术公开了一种富硒植物干粉中硒形态测定的方法，属于分析测试领域。采用超声辅助提取富硒植物干粉中的游离态含硒物质，离心后在沉淀物中加入含十二烷基硫酸钠(SDS)的提取溶液，采用双酶法两次酶解提取结合态含硒物质。收集各步得到的上清液过膜，浓缩后的溶液注入GPC系统进行分离，收集小分子馏分，浓缩后采用液相色谱‑原子荧光联用仪(HPLC‑AFS)或高效液相色谱‑电感耦合等离子体质谱联用仪(HPLC‑ICP‑MS)测定各硒形态含量。此方法提取时间短，提取效率高，所用酶成本低，处理过程中硒形态稳定。

【技术实现步骤摘要】
一种富硒植物干粉中硒形态测定的方法
本专利技术涉及一种富硒植物干粉中硒形态测定的方法，属于分析测试领域。
技术介绍
硒是人体的一种必需微量元素，被列为15种营养素之一。硒有抗氧化，抗肿瘤，抗炎症，抗衰老等作用。多个国家和地区都处于饮食缺硒状态，我国有七成地区处于缺硒地带，据报道许多成人硒日摄入量低于中国营养学会推荐剂量。人体中硒缺乏时，会引起许多病变，因此日常补硒非常必要。现在开发安全有效的补硒产品已经成为我国富硒保健产品的重点，许多补硒产品的利用价值不仅与硒含量有关还与硒的化学形态相关。自然界中的硒主要以无机硒、有机硒和单质硒三种形式存在。不同形态的硒的功能性也有差异，其中无机硒的毒性较大，且生物有效低。有机硒由于其低毒性，高生物利用度的特点，被认为是优质硒。植物是硒生态链不可缺少的关键环节，它们可以吸收无机硒，将其转化为有机硒化合物，因此植物被认为是天然有机硒合成的生化工厂。植物中的有机硒占硒总量80％以上，主要由硒蛋白和以硒代氨基酸及其衍生物形式存在的小分子硒化物组成，植物源含硒化合物已经成为获取有机硒的重要途径。因此利用富硒农作物转化有机硒，建立日常食物摄取的硒营养模式，已成为目前功能性食品的研究热点之一。由于植物样品基体复杂，含硒化合物形态多样，不稳定，且含量非常低，因此在对植物样品进行硒形态分析时，预处理的方法既要考虑到较高的回收率，也要保持初始的形态不会发生转变。水提取法和弱酸提取法主要适用于小分子含硒化合物的提取，在提取过程中可能会出现硒形态转变或有机硒的降解。而对于结合在蛋白上的含硒化合物，酶解法不但能够有效地将其释放，而且温和的提取条件可以更小程度的减少形态的转化。目前关于植物源有机硒硒形态分析测定方法并不完善，其中对样品进行预处理是主要的技术难点。现有的硒形态分离方法，反应时间长，容易导致硒形态的转化；并且所选用的蛋白酶成本高，在应用中推广受限。所以开发一种成本低，效率高的富硒植物干粉预处理以及硒形态分析方法非常必要。
技术实现思路
[技术问题]目前关于植物源有机硒硒形态分析测定方法并不完善，其中对样品进行预处理是主要的技术难点。现有的硒形态分离的方法，反应时间长，容易导致硒形态的转化；并且所选用的蛋白酶成本高，在应用推广中受限。[技术方案]针对上述问题，本专利技术提供了一种测定富硒植物干粉中硒形态的方法，在对富硒植物干粉预处理的过程中，本专利技术采用了双酶先后酶解的方法，双酶为风味蛋白酶和蛋白酶E，通过二次酶解进一步对沉淀中残余的含硒物质进行提取，保证含硒化合物的提取效果和稳定性。本专利技术的预处理方法具有提取效率高，时间短，操作简单等优点。本专利技术提供了一种测定富硒植物干粉中硒形态的方法，技术方案如下：(1)样品中游离态的硒物质的提取：取富硒植物干粉样品，加水溶解进行提取并取上清，得到上清液1；(2)样品中结合态的硒物质的酶解提取：取步骤(1)离心后的沉淀物，将其溶于含十二烷基硫酸钠(SDS)的提取溶液中，分步依次加入风味蛋白酶、蛋白酶E，进行酶解，酶解后离心取上清，得到上清液2；(3)样品二次酶解：取步骤(2)离心后的沉淀物重复步骤(2)中的操作进行酶解，酶解后离心取上清，得到上清液3。(4)样品检测：收集各步得到的上清液过膜，浓缩后的溶液注入凝胶渗透色谱柱(GPC)系统进行分离，收集小分子馏分，浓缩后测定各硒形态。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中称取富硒植物干粉样品，加水溶解后利用超声辅助提取，超声结束后离心取上清，得到上清液1。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)富硒植物干粉与水的质量体积比为1：(50-70)，超声时温度控制在35-50℃，在30～50KHz超声15-25min。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中所述的提取溶液为去离子水或pH值为7.5的20mMTris-HCL溶液。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中SDS的加入量为提取溶液的0.05-0.15wt％。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中所述经超声后的富硒植物干粉沉淀物与含SDS的提取溶液的质量体积比1：(50-70)。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中风味蛋白酶和蛋白酶E与所述经超声后的富硒植物干粉沉淀物质量比例均为1：(10-40)，酶解温度为40-50℃，酶解时间4-5小时。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中风味蛋白酶和蛋白酶E添加顺序为先加风味蛋白酶酶解4-5小时，再加蛋白酶E继续酶解4-5小时。在本专利技术的一种方式中，步骤(4)中收集各步得到的上清液过膜，浓缩后的溶液注入凝胶渗透色谱柱(GPC)系统进行分离，收集小分子馏分，浓缩后测定各硒形态。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(4)中所述GPC分离的具体参数为：色谱柱填料：Superdex75凝胶过滤填料；洗脱剂：去离子水或pH值为7.5的20mMTris-HCL溶液；流速：1.0mL/min。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(4)中浓缩后采用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱仪(HPLC-HG-AFS)或高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱仪(HPLC-ICPMS)测定各硒形态。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(4)所述HPLC-HG-AFS测定各硒形态含量的方法为：色谱柱：HamiltonPRP-X100阴离子交换柱(250mm×4mm，10μm)；流动相：流动相A：40mmol/L(NH4)2HPO4，pH＝6.0；流动相B：60mmol/L(NH4)2HPO4；进样体积：100μL；流速：1.0mL/min。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(4)所述HPLC-ICPMS测定各硒形态含量的方法为：ThermoScientificHypersilGOLDC8(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：20mmol/L磷酸二氢钾(含0.05wt.％七氟丁酸，3wt.％甲醇)；进样体积15μL；流速：1.2mL/min。[有益效果]：(1)本专利技术在进行游离硒的超声法提取时，对富硒植物干粉紧密的纤维组织结构进行了破坏，为酶解提供了较好的条件。SDS的加入破坏了富硒植物干粉中的蛋白结构，蛋白结合态含硒物质更有利于被提取。(2)本专利技术选择的蛋白酶为风味蛋白酶和蛋白酶E，这两种酶与文献报道经常使用的蛋白酶K和蛋白酶XIV便宜，降低了样品的预处理成本。(3)本专利技术中的酶解手段采用双酶先后酶解的方法，二次酶解进一步对沉淀中残余的含硒物质进行提取，保证含硒化合物的提取效果和稳定性。本专利技术具有提取效率高，时间短，操作简单等优点。附图说明图1为实施例1中不同形态硒标准溶液色谱图。图2为对比例1中不同酶种类在不同酶解时间条件下硒提取率。图3为对比例2中不同加酶方式下硒提取率。图4为对比例3中不同酶解次数下硒提取率。具体实施方式【实施例1】(1)取0.1g碎米荠干粉溶于5mL去离子水中，控制温度为40℃，40KH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定富硒植物干粉中硒形态的方法，其特征在于，所述方法如下：/n(1)样品中游离态的硒物质的提取：称取富硒植物干粉样品，加水溶解进行提取并取上清，得到上清液1；/n(2)样品中结合态的硒物质的酶解提取：取步骤(1)离心后的沉淀物，将其溶于含十二烷基硫酸钠的提取溶液中，分步依次加入风味蛋白酶、蛋白酶E，进行酶解，酶解后离心取上清，得到上清液2；/n(3)样品二次酶解：取步骤(2)离心后的沉淀物重复步骤(2)中的操作进行酶解，酶解后离心取上清，得到上清液3；/n(4)样品检测：合并上清液1、2、3，浓缩后的溶液注入凝胶渗透色谱柱系统进行分离，收集小分子馏分，浓缩后测定各硒形态。/n

【技术特征摘要】
1.一种测定富硒植物干粉中硒形态的方法，其特征在于，所述方法如下：
(1)样品中游离态的硒物质的提取：称取富硒植物干粉样品，加水溶解进行提取并取上清，得到上清液1；
(2)样品中结合态的硒物质的酶解提取：取步骤(1)离心后的沉淀物，将其溶于含十二烷基硫酸钠的提取溶液中，分步依次加入风味蛋白酶、蛋白酶E，进行酶解，酶解后离心取上清，得到上清液2；
(3)样品二次酶解：取步骤(2)离心后的沉淀物重复步骤(2)中的操作进行酶解，酶解后离心取上清，得到上清液3；
(4)样品检测：合并上清液1、2、3，浓缩后的溶液注入凝胶渗透色谱柱系统进行分离，收集小分子馏分，浓缩后测定各硒形态。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中富硒植物干粉与水的质量体积比为1：(50-70)，加水溶解后利用超声辅助提取，超声时温度控制在35-50℃，在30～50KHz超声15-25min。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的提取溶液为去离子水或pH值为7.5的20mMTris-HCL溶液。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中十二烷基...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱松，林樾，丛欣，于添，李玥，
申请(专利权)人：江南大学，恩施德源健康科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32