乳铁蛋白适配体亲和柱及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供一种乳铁蛋白适配体亲和柱及其制备方法与应用。该亲和柱以N‑羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，将能够高亲和力、高特异性识别乳铁蛋白的核酸适配体与载体进行共价偶联，偶联后特异性亲和填料装填固相萃取柱。该亲和柱主要应用于样品中乳铁蛋白特异性识别和富集纯化，纯化后仍能保持乳铁蛋白的天然活性，该方法快速、简便、准确，亲和柱可重复使用，既可用于大型仪器检测前的样品前处理，也可用于乳铁蛋白的分离纯化，在化妆品、食品、动物生产、医疗等领域中具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
乳铁蛋白适配体亲和柱及其制备方法与应用
本专利技术属于生物检测
，具体地说，涉及一种乳铁蛋白适配体亲和柱及其制备方法与应用。
技术介绍
乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是一种相对分子量约为80KDa的非血红素铁结合性蛋白，主要存在于哺乳动物的乳汁当中，特别是初乳中乳铁蛋白含量较高。乳铁蛋白具有多种生物学功能，它不仅可以调节人体铁质转移，促进骨骼生长，而且具有抗菌、抗病毒、抗氧化、调节免疫等功能。目前，其已被认为是安全的食品添加剂，广泛应用在乳制品及相关的婴幼儿配方食品、特殊医学用途配方食品、保健食品和医药等领域。但迄今为止还没有关于乳铁蛋白的国家检测标准。常用的乳铁蛋白检测技术主要有：酶联免疫吸附法、毛细管电泳法、分光光度法、高效液相色谱法等。其中，高效液相色谱法具有分离效率高，选择性好，灵敏度高等优点，是目前食品检测领域应用最广泛的方法之一。因高效液相色谱对样品纯度要求较高，且乳制品及相关样品的基质成分相当复杂，故无法直接进行液相色谱检测，目前常用肝素亲和柱来分离纯化目标物，但肝素亲和柱价格昂贵，增加了检测成本。核酸适配体是一小段体外筛选得到的寡核苷酸片段，能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合。适配体本质上是具有特定复杂三维结构并能特异性结合靶标的一段脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)序列(10～100个碱基)。单链的核酸序列可以形成二级结构，从而对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。通过构建单链随机寡核苷酸文库，利用指数富集配体系统进化技术(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)进行多次富集和筛选，体外优选出能特异性与靶标高度亲和的核酸适配体，从而避免了体内免疫反应带来的困难。适配体作为一种在体外人工合成的，与抗体功能类似的新型分子，与主流的抗体技术相比，其研究尚处于起步阶段，但已经表现出一些有别于抗体的优势，如批间稳定性一致，易修饰，无免疫原性等。基于适配体的亲和柱是一种新型高效的样品前处理技术。它的原理是利用适配体对靶分子的选择性吸附来实现对复杂样品中靶分子的提取和净化，这种吸附是可逆的。适配体亲和柱纯化结合常规高效液相色谱检测目标物将成为重要的发展方向。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种乳铁蛋白适配体亲和柱及其制备方法与应用。本专利技术的构思如下：将高特异性、高亲和力的乳铁蛋白的核酸适配体通过C7或C6间接臂进行氨基化修饰后与N-羟基琥珀酰亚胺(-NHS)修饰的载体通过共价键进行偶联。经过洗涤和封闭得到乳铁蛋白的特异性偶联胶。偶联胶装柱后组装成高亲和力的乳铁蛋白适配体亲和柱。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种乳铁蛋白的核酸适配体，核酸序列如SEQIDNO:1所示。第二方面，本专利技术提供所述适配体在制备乳铁蛋白检测试剂或乳铁蛋白适配体亲和柱中的应用。第三方面，本专利技术提供一种乳铁蛋白适配体亲和柱，所述亲和柱的填料是以N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，然后将SEQIDNO:1的适配体与载体进行共价偶联得到的。优选地，所述适配体是经过氨基修饰的适配体序列，修饰方法如下：在核酸适配体的3’或5’端通过共价键连接C7间接臂-(CH2)7-或C6间接臂-(CH2)6-，然后在C7间接臂或C6间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体。第四方面，本专利技术提供所述乳铁蛋白适配体亲和柱的制备方法，包括以下步骤：1)载体的洗涤：取300μLN-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖置于离心管中，用1mM盐酸洗涤1-2次，每次1-2mL；2)适配体复性：取1OD的5’端氨基修饰的乳铁蛋白适配体溶解于500μLMES缓冲液中，于92-96℃复性5-10min，然后室温放置30-60min；3)偶联：向洗涤后的载体中加入复性好的适配体溶液，于20-30℃(优选25℃)摇床震荡反应0.5h；4)封闭：偶联产物离心去除上清后，加入1mL封闭缓冲液，于20-30℃(优选25℃)摇床震摇反应1h，得到载体-适配体填料；5)洗涤：将上述载体-适配体填料用清洗缓冲液洗涤(优选洗涤2次)，除去未偶联的适配体。洗涤后的偶联胶用1mL结合缓冲液重悬，所得偶联胶悬液准备装柱；6)装柱：取容积1mL的固相萃取柱，垫好下筛板，用上述偶联胶悬液装柱，至胶高度为1-1.5cm，加入结合缓冲液0.5-3mL，于4℃保存。所述MES缓冲液：0.1MMES,0.15MNaCl,pH6.0；所述封闭缓冲液：0.2％BSA,0.1MMES,0.15MNaCl,pH6.0；所述清洗缓冲液：50mMTris-HCl,0.15MNaCl,pH7.2；所述结合缓冲液：137mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4·12H2O,2mMNaH2PO4,1mMMgCl2,2mMCaCl2,pH7.5。前述的方法，步骤7)所述固相萃取柱及下筛板的材质可选自聚丙烯、聚苯乙烯、多孔聚苯乙烯或交联多孔聚苯乙烯。优选地，下筛板的孔径为10μm。第五方面，本专利技术提供所述乳铁蛋白适配体亲和柱或按照上述方法制备的亲和柱在富集和/或纯化样品中乳铁蛋白中的应用。所述样品可选自乳制品(牛奶)、化妆品、食品、动物饲料、医药。本专利技术乳铁蛋白适配体亲和柱的结构示意图见图1，工作原理见图2。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：(一)该亲和柱具有操作简便，价格低廉，纯化乳铁蛋白效率高，可重复使用的优点。样品经过简单的提取后，即可上柱进行净化，一次净化能够除去绝大部分干扰物。净化后的提取液可用高效液相色谱等仪器进行分析检测，且保持乳铁蛋白的天然活性。(二)本专利技术充分利用了核酸适配体高特异性、高亲和力的优点，利用乳铁蛋白适配体特异性结合样品中的乳铁蛋白，降低了基于抗体的免疫亲和柱经常遇到的交叉反应，亲和柱的净化效率大幅度提高。核酸适配体受操作环境和有机溶剂的影响较小，尤其适合各行业生产线现场的纯化。相比之下，由于免疫亲和柱中的抗体不耐有机溶剂，有机溶剂的存在常常会造成抗体的失活而使亲和柱效率降低。此外，由于有机溶剂可能导致抗体失活，因此免疫亲和柱通常为一次性使用。而核酸适配体亲和柱可以耐受多种缓冲液，可重复使用多次，大幅度降低了使用成本。(三)本专利技术使用的核酸适配体通过体外化学合成法获得，能够保证序列的正确性、批间的一致性，大幅度降低了不同批次间的差异。相比之下，不同批次的抗体来自于不同的小鼠或者兔子，导致抗体间质量差异较大，从而使免疫亲和柱的质量存在批间差异。(四)N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖与氨基修饰的适配体发生共价偶联，偶联产物稳定，且偶联率高。(五)本专利技术制备的适配体亲和柱以核酸适配体代替抗体作为识别元件，与传统的免疫亲和柱相比，具有成本低，易于保存，性质稳定，批间差异小的优点。样品提取液经适配体亲和柱净化后，所得乳铁蛋白纯度高，无需后续纯化处理本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.乳铁蛋白的核酸适配体，其特征在于，核酸序列如SEQ ID NO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.乳铁蛋白的核酸适配体，其特征在于，核酸序列如SEQIDNO:1所示。


2.权利要求1所述适配体在制备乳铁蛋白检测试剂或乳铁蛋白适配体亲和柱中的应用。


3.乳铁蛋白适配体亲和柱，其特征在于，所述亲和柱的填料是以N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，然后将权利要求1所述适配体与载体进行共价偶联得到的。


4.根据权利要求3所述的亲和柱，其特征在于，所述适配体是经过氨基修饰的适配体序列，修饰方法如下：在核酸适配体的3’或5’端通过共价键连接C7间接臂-(CH2)7-或C6间接臂-(CH2)6-，然后在C7间接臂或C6间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体。


5.权利要求4所述亲和柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)载体的洗涤：取300μLN-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖置于离心管中，用1mM盐酸洗涤1-2次，每次1-2mL；
2)适配体复性：取1OD的5’端氨基修饰的乳铁蛋白适配体溶解于500μLMES缓冲液中，于92-96℃复性5-10min，然后室温放置30-60min；
3)偶联：向洗涤后的载体中加入复性好的适配体溶液，于20-30℃摇床震荡反应0.5h；
4)封闭：偶联产物离心去除上清后，加入1mL封闭缓冲液，于20-30℃摇床震摇反应1h，得到载体-适...

【专利技术属性】
技术研发人员：栾云霞，陆安祥，郭晓军，
申请(专利权)人：北京农业质量标准与检测技术研究中心，北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京;11