一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中3种脂质的方法技术

本发明专利技术公开了一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中3种脂质的方法，所述3种脂质分别为：α‑HB、OA和LGPC；采用超高效液相色谱串联质谱法检测预处理的血浆中的脂质的含量，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出3种脂质的含量；采用本发明专利技术的技术方案，将血浆样本与所有待测物的混合内标溶液混合，样本无需衍生化处理，前处理简单，只需一步蛋白沉淀处理，样本用量小，灵敏度高，特异性强，5.0分钟之内可同时检测3种脂质，可用于临床上血浆脂质的诊断及健康评估。

【技术实现步骤摘要】
一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中3种脂质的方法
本专利技术属于血液检测
，更具体的是涉及一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中3种脂质的方法。
技术介绍
糖尿病是一种最常见的内分泌代谢疾病，具有遗传易感性，在环境因素的出发下发病。随着社会经济的发展、人们生活方式的改变及人口老龄化，2型糖尿病占糖尿病总体人群95％以上,患病率高,起病隐匿,早期症状不明显,2型糖尿病发病率在全球范围内呈逐年增高趋势，尤其在发展中国家增加速度更快，呈流行势态。糖尿病现已成为继心血管冰和肿瘤之后，第三位威胁人类生命健康的非传染性疾病。2型糖尿病流行病学主要调查其患病率。但是，通过改变生活方式、适当的营养管理和/或治疗干预，可以延迟或预防糖尿病前期到显性2型糖尿病的进展。因此，早期发现糖尿病前期是控制糖尿病流行的关键。目前糖尿病前期的定义是使用一个或多个基于血糖的检测标准，包括空腹血糖(FPG)、血红蛋白A1c和2小时血糖。但是这些检测标准反应里导致2型糖尿病的不同病理生理状态，可能只在有限的受试群体中检测到糖尿病前期。为了更准确的诊断糖尿病前期状态，如胰岛素抵抗(IR)和糖耐受量受损(IGT)，有必要识别和量化疾病特异性生物标志物。目前有研究表明有三种脂质，包括α-羟基丁酸(2-hydroxybutyricacid，α-HB)、油酸(oleicacid，OA)和亚油酰甘油磷酸胆碱(1-linoleoylglycerophosphocholine，L-GPC)与胰岛素测量作为胰岛素抗体(IR)的生物标志物，但关于如何对其进行共同检测，目前所做研究还较少，因此有必要研究开发一种简单、高效且可靠的血浆中α-HB、OA和LGPC的检测方法，满足临床应用的需求。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中3种脂质的方法，所述3种脂质分别为：α-羟基丁酸(α-HB)、油酸(OA)和亚油酰甘油磷酸胆碱(LGPC)；上述3种脂质对应的同位素内标物分别为：α-羟基丁酸-d3(α-HB-d3)、油酸-13C18(OA-13C18)和亚油酰甘油磷酸胆碱-d9(LGPC-d9)；为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中3种脂质的方法，所述3种脂质分别为：α-HB、OA和LGPC；采用超高效液相色谱串联质谱法检测预处理的血浆中的脂质的含量，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出血浆中3种脂质的含量；(1)具体色谱条件：流动相A：含0.01～0.5％甲酸的水；流动相B：乙腈；色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC18(2.1×50mm,1.7μm)；采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，见表1；流速为0.3～0.6mL/min，柱温为40～60℃，进样体积为0.5～5μL；表1流动相梯度洗脱参数(2)具体质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，多反应监测(MRM)的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)及2.5kV(ESI-)；源温度：120℃；雾化气温度：400℃，雾化气流速：800L/h，锥孔气流速：150L/h；同时监测目标物对应的标准品和内标母离子、子离子、去簇电压和碰撞电压，参数见表2；表2质谱检测参数其中，所述血浆为人或动物血浆。其中，所述经过预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆加入混合内标工作液，涡旋后加入蛋白沉淀剂，再涡旋离心后取上清液。其中，所述的标准品按照如下步骤制备得到：称取各待测物标准品，将α-HB、OA加入甲醇溶解，LGPC加入氯仿完全溶解，配制成浓度依次为α-HB20mM、OA100mM、LGPC200mM的标准品母液，然后分别移取α-HB200μL、OA200μL、LGPC400μL，加入200μL甲醇溶液，充分混匀得到1mL混合标准品储备液；将上述混合标准品储备液以空白血浆基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，取10μL混合标准品储备液至1.5mL离心管中，加入190μL空白血浆基质得到第一个高值浓度点(S7)，取第一高值浓度点(S7)用等体积空白血浆基质稀释得第二高值浓度点(S6)；取第一高值浓度点(S7)用4倍体积空白血浆基质稀释得第三高值浓度点(S5)；取第二高值浓度点(S6)用4倍体积空白血浆基质稀释得第四高值浓度点(S4)；取第三高值浓度点(S5)用4倍体积空白血浆基质稀释得第五高值浓度点(S3)；取第四高值浓度点(S4)用4倍体积空白血浆基质稀释得第六高值浓度点(S2)；取第五高值浓度点(S3)用4倍体积空白血浆基质稀释得第七高值浓度点(S1)；所述标准品溶液的七个浓度点为：α-羟基丁酸的浓度依次：2μM、4μM、8μM、20μM、40μM、100μM、200μM；油酸的浓度依次为：10μM、20μM、40μM、100μM、200μM、500μM、1000μM；亚油酰甘油磷酸胆碱的浓度依次为：40μM、80μM、160μM、400μM、800μM、2000μM、4000μM。其中，所述的混合内标工作液按如下方法制备得到：称取各同位素内标物，将α-HB-d3、OA-13C18加入甲醇溶解，LGPC-d9加入氯仿溶解，配制成浓度依次为50mM、100mM、200mM的同位素内标母液；然后分别移取α-HB-d34μL、OA-13C1810μL、LGPC-d920μL，加入甲醇966μL，充分混匀得到1mL混合内标溶液；取100μL混合内标溶液，加入900μL甲醇，混合均匀得混合内标工作液。其中，所述的经过预处理的血浆按照如下方法制备：取20μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后加入760μL蛋白沉淀剂，在12000～15000r/min，10～20℃离心4～10min后，取70μL上清液。其中，所述空白血浆基质为1～10％牛血清蛋白(BSA)水溶液。其中，所述的蛋白沉淀剂为甲醇与乙腈的体积比为1:1的混合溶液。有益效果：采用本专利技术的技术方案，将血浆样本与所有待测物的混合内标溶液混合，样本无需衍生化处理，前处理简单，只需一步蛋白沉淀处理，样本用量小，灵敏度高，特异性强，5分钟之内可同时检测3种脂质，可用于临床上血浆脂质的诊断及健康评估。附图说明图1为3种脂质标准品的选择离子流色谱图；图2为血浆样本中3种脂质的选择离子流色谱图。具体实施方式为了加深对本专利技术的理解，下面将结合实施例和附图对本专利技术作进一步详述，该实施例仅用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术保护范围的限定。实施例11.材料(1)仪器：XevoTQ-S三重四级杆质谱仪(WatersCor本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中3种脂质的方法，其特征在于，所述3种脂质分别为：α-HB、OA和LGPC；/n采用超高效液相色谱串联质谱法检测预处理的血浆中的脂质的含量，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出3种脂质的含量；/n(1)色谱条件：/n流动相A：含0.01～0.5％甲酸的水；/n流动相B：乙腈；/n色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18(2.1×50mm,1.7μm)；/n采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，见表1；/n流速为0.3～0.6mL/min，柱温为40～60℃，进样体积为0.5～5μL；/n表1 流动相梯度洗脱参数/n

【技术特征摘要】
1.一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中3种脂质的方法，其特征在于，所述3种脂质分别为：α-HB、OA和LGPC；
采用超高效液相色谱串联质谱法检测预处理的血浆中的脂质的含量，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出3种脂质的含量；
(1)色谱条件：
流动相A：含0.01～0.5％甲酸的水；
流动相B：乙腈；
色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC18(2.1×50mm,1.7μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，见表1；
流速为0.3～0.6mL/min，柱温为40～60℃，进样体积为0.5～5μL；
表1流动相梯度洗脱参数



(2)质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，多反应监测(MRM)的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)及2.5kV(ESI-)；源温度：120℃；雾化气温度：400℃，雾化气流速：800L/h，锥孔气流速：150L/h；同时监测目标物对应的标准品和内标母离子、子离子、去簇电压和碰撞电压，参数见表2；
表2质谱检测参数





2.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中3种脂质的方法，其特征在于，所述血浆为人或动物血浆。


3.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中3种脂质的方法，其特征在于，所述经过预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆加入混合内标工作液，涡旋后加入蛋白沉淀剂，再涡旋离心后取上清液。


4.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中3种脂质的方法，其特征在于，所述的标准品按照如下步骤制备得到：
称取各待测物标准品，将α-HB、OA加入甲醇溶解，LGPC加入氯仿完全溶解，配制成浓度依次为α-HB20mM、OA100mM、LGPC200mM的标准品母液，然后分别移取α-HB200μL、OA200μL、LGPC400μL，加入200μL甲醇溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：成晓亮，李美娟，
申请(专利权)人：南京品生医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32