一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析方法技术

本发明专利技术涉及一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析新方法及应用，包括Lys‑C/Trypsin/Arg‑C连续酶切、酶切肽段N段氨基的固定、甲基化修饰肽段的选择性释放及LC‑MS/MS分析及数据解析甲基化修饰位点信息。首先对含有蛋白质甲基化修饰的样本进行Lys‑C/Trypsin/Arg‑C多种酶切消化，然后将连续酶切得到的肽段与氨基反应活性材料反应，实现肽段的固定，最后利用特异性酶对固定肽段中含有甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸N端肽键特异性酶切。本发明专利技术的优点是实现了多种类型低丰度蛋白质甲基化修饰的同时富集，包括赖氨酸二甲基化修饰、赖氨酸三甲基化修饰、精氨酸单甲基化修饰以及精氨酸二甲基化修饰。

An antibody independent method for protein methylation and enrichment

【技术实现步骤摘要】
一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析方法
本专利技术涉及一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析新方法及应用，实现了多种类型蛋白质甲基化修饰的同时分析。
技术介绍
蛋白质甲基化修饰是一种广泛存在的且具有重要生物功能的翻译后修饰之一，如组蛋白质甲基化修饰参与基因的转录、DNA的损伤修复、信号传导等多种生命活动过程。蛋白质甲基化修饰的调控异常与多种疾病存在着密切的联系，如蛋白质甲基化修饰调控异常与乳腺癌、肺癌、淋巴癌、艾滋病以及心血管疾病等密切相关。此外蛋白质甲基化修的动态变化对生命活动具有重要的调节作用，如Jarid2蛋白质116赖氨酸甲基化修饰(Kme)通过增强甲基化转移酶复合体PRC2的活性进而调节组蛋白H3上27位赖氨酸三甲基化修饰(H2K27me3)的聚集，Jarid2的K116me和组蛋白H3K27me3之间的交互作用(cross-talk)对胚胎干细胞的分化具有重要的作用(MolecularCell，2015，57(5)：769-783)；TP53蛋白质370位发生二甲化修饰时，TP53则表现为激活状态；在LSD1去甲基化酶的作用下转变为单甲基化修饰时，此时的TP53表现为失活状态,通过对TP53的甲基化状态的调控，从而调节TP53的肿瘤抑制和转录调控作用(Nature，2007，449(7158)：105-108)。因此对生物体内蛋白质甲基化修饰位点进行深度覆盖分析，对研究蛋白质甲基化修饰以及cross-talk在疾病的发生发展中的调控作用具有重要意义。蛋白质甲基化修饰主要集中在赖氨酸和精氨酸残基侧链上，赖氨酸残基能够发生单甲基化、二甲基化和三甲基化修饰，而精氨酸残基能够发生单甲基化、对称二甲基化和非对称二甲基化修饰。由于蛋白质甲基化修饰不仅丰度低，而且具有多样性及复杂性程度高等特点，在蛋白质组学水平上对蛋白质甲基化位点进行深度覆盖分析仍十分困难。而甲基化肽段的富集分离困难是影响其分析的主要原因，目前，甲基化修饰肽段的富集主要是基于抗体的免疫沉淀法。然而甲基化引入的修饰基团较小，对修饰后氨基酸的理化性质改变也较小，难以获得高特异性的抗体对甲基化修饰肽段进行有效富集，因此利用抗体对甲基化修饰肽段的富集效率低以及特异性差(NatureProtocol，2014，9(1)：37-50)。近年来出现了利用化学衍生化方法、抗体改造以及利用天然甲基结合域蛋白质对甲基化修饰位点进行富集的策略。利用化学衍生化方法是在修饰基团引入可富集基团(MolecularCell，2013，50(5)：723-735)，通过细胞代谢将含有可富集的甲基基团转移到蛋白上，通过对可富集基团的解析得出甲基化修饰位点，该方法无法应用于临床样本且难以代表生理状态下的甲基化修饰位点限制了该方法的应用；而利用改造后的抗体和天然甲基结合域对甲基化修饰进行富集，尽管提高了抗体的特异性和效率，但是难以实现对不同类型的赖氨酸和精氨酸甲基化修饰的同时富集，而且需要准备非常大量的全蛋白才能够实现对单一类型甲基化修饰肽段的富集检测，如Wu等利用改造后的抗体对150mg的全蛋白质进行了80次抗体富集后，仅仅鉴定出446个赖氨酸单甲基化修饰(MolecularCellProteomics，2015，14(2)：329-339)，同时该类方法不能对多种赖氨酸和精氨酸甲基化化修饰进行同时富集，因此利用抗体富集和甲基化结合域难以实现对甲基化修饰的深度覆盖分析。为了实现对多种蛋白质甲基化修饰的深度鉴定，出现了利用Trypsin无法水解甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸从而使得甲基化修饰肽段在碱性条件多一个电荷的特性，使用强阳离子交换柱(SCX)对甲基化修饰的肽段进行非抗体方法的富集后进行质谱鉴定，最终在768个蛋白质上鉴定出887个甲基化修饰位点(AnalyticalChemistry，2016，88(23)：11319-11327)。由于该方法是利用强阳离子交换柱对甲基化修饰的肽段进行富集，很容易受到在碱性条件下带正电氨基酸的干扰，对甲基化修饰肽段的富集效率较低，难以实现蛋白质甲基化修饰的深度覆盖分析。因此，开发蛋白质甲基化修饰肽段高选择性的富集方法，提高甲基化修饰肽段的富集效率，是实现生物体内甲基化修饰位点的全面深度覆盖分析的关键所在，对研究蛋白质甲基化动态修饰的功能和调控机制具有重要意义。针对目前蛋白质甲基化修饰分析过程中的富集特异性差、难以实现规模化分析以等问题，通过利用Lys-C/Trypsin/Arg-C多种酶对样本进行酶切，降低无甲基化修饰赖氨酸和精氨酸酶漏切，然后利用氨基反应活性材料与多种酶切得到的肽段反应，实现肽段的固定，最后利用Lysarginase或者Trypsin-N对固定肽段中含有甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸N端肽键特异性酶切，实现甲基化修饰肽段的释放，利用亲和色谱或者分子筛将固相材料与释放的甲基化修饰肽段进行分离，从而实现多种内源性甲基化修饰肽段的高选择性同时富集，
技术实现思路
本专利技术发展了一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析新方法，本专利技术的优点是实现了多种类型低丰度蛋白质甲基化修饰的同时富集，包括赖氨酸二甲基化修饰、赖氨酸三甲基化修饰、精氨酸单甲基化修饰以及精氨酸二甲基化修饰。为了实现该目的，本专利技术的技术方案是：1、采用Lys-C/Trypsin/Arg-C连续酶切对蛋白质进行酶切使用8M尿素或者6M盐酸胍作为裂解液进行蛋白质的提取，然后加入终浓度为10mM的二硫苏糖醇，于56度反应30min，然后加入终浓度为30mM的碘乙酰胺，于室温避光反应30min，最后使用终浓度为30mM的二硫苏糖醇于室温反应30min终止过量的碘乙酰胺。按照Lyc-C比蛋白质的质量比为0.2至0.002加入Lys-C，调节pH值为7.4，37度消化4h，然后将尿素或者盐酸胍浓度稀释至1M以下，按照Trypsin比蛋白质的质量比为0.2至0.002加入Trypsin，调节pH值为7.4，37度消化过夜。将得到的蛋白酶酶切肽段使用反相C18柱进行除盐并干燥，然后将干燥后的肽段溶解在含有5mM的氯化钙、5mM的二硫苏糖醇、2mM的EDTA的20mM的HEPES中，调节pH值为7.4，按照Arg-C比蛋白质的质量比为0.2至0.002加入Arg-C，37度消化过夜。使用10kD的滤膜去除Arg-C，将得到的肽段合，并用于后续的固定化标记。2、使用氨基活材料固定上述酶切得到的肽段氨基活性材料可以是N-羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖、溴化氰活性琼脂糖、异氰酸树脂、醛基功能化材料等能够与氨基进行共价反应的材料，将上述材料加入到Lys-C/Trypsin/Arg-C连续酶切得到的肽段体系中，调节pH为3-12，20-65度10min至24h。使用氨水、碳酸氢铵、乙醇胺、Tris-Cl等含有自由氨基的试剂中和材料上没有反应的活性基团，试剂使用浓度为1mM-1000mM，20-70度反应5min至4h。根据氨基活性材料的性质，使用离心、亲和色谱、分子筛等方法去除多余试剂以及没有被固定的肽段，得到还有固定化肽段修饰的材料。3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析方法，包括：甲基化修饰的样品的Lys-C/Trypsin/Arg-C分别连续酶切；肽段N端氨基的固定；甲基化修饰肽段选择性释放及分离；LC-MS/MS分析及数据解析甲基化修饰位点信息。/n

【技术特征摘要】
1.一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析方法，包括：甲基化修饰的样品的Lys-C/Trypsin/Arg-C分别连续酶切；肽段N端氨基的固定；甲基化修饰肽段选择性释放及分离；LC-MS/MS分析及数据解析甲基化修饰位点信息。


2.按照权利要求1的分析方法，其特征在于：连续酶切过程为，采用Lys-C(胞内蛋白酶)、Trypsin(胰蛋白酶)、Arg-C(梭菌蛋白酶)对蛋白质进行连续酶切，通过降低无甲基化修饰赖氨酸和精氨酸的漏切，从而降低无甲基化修饰肽段对甲基化修饰肽段的干扰。


3.按照权利要求1的分析方法，其特征在于：酶切肽段N端氨基的固定过程为，采用氨基活性试剂与肽段N端的α-氨基反应，将肽段固定在固相载体或者高分子材料上。


4.按照权利要求1的分析方法，其特征在于：甲基化修饰肽段选择性的从材料上释放及分离过程为，利用具有酶切甲基化修饰赖氨酸和精氨酸能力的酶对固定的肽段进行酶切，可以实现固定肽段中的甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸N端肽键水解，从而将甲基化修饰的肽段从材料上释放，根据材料的特性，利用亲和色谱或者分子筛将甲基化修饰的肽段与材料进行分离，从而实现甲基化修饰肽段的选择性富集。


5.按照权利要求1的分析方法，其特征在于：LC-MS/MS分析及数据解析甲基化修饰位点信息过程为，利用LC对肽段进行分离，利用ESI电离方式对分离的肽段进行离子化，通过高分辨率质谱分析离子化的肽段一级谱和二级谱，并利用搜索软件对质谱数据进行解析，从而鉴定出甲基化修饰肽段的信息。


6.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：利用Lys-C/Trypsin/Arg-C对蛋白质进行酶切，三种蛋白水解酶用量为蛋白质质量的分别为1/5-1/500，在20-50℃酶解2-48h。

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，孙明伟，梁振，单亦初，赵宝锋，杨开广，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21