蛋鸡低骨密度联合诊断血清代谢标志物的筛选方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种筛选蛋鸡低骨密度血清代谢标志物的方法，以及从老年笼养蛋鸡中筛选得到的一组用于联合诊断低骨密度的血清代谢标志物，所述标志物包括与骨密度正相关的七种代谢物和与骨密度负相关的一种代谢物。本发明专利技术可通过检测蛋鸡血清或血浆中这八种代谢标志物联合预测笼养蛋鸡低骨密度的风险，进而实现笼养蛋鸡骨质疏松症的有效预防，在蛋鸡养殖行业提高经济效益及动物福利方面具有重要意义。

Screening method and application of serum metabolic markers in the diagnosis of low bone density in laying hens

【技术实现步骤摘要】
蛋鸡低骨密度联合诊断血清代谢标志物的筛选方法及其应用
本专利技术属于生物检测和诊断领域，具体涉及一种蛋鸡低骨密度联合诊断血清代谢标志物的筛选方法，本专利技术还涉及一组用于蛋鸡低骨密度联合诊断血清代谢标志物及其检测方法。
技术介绍
笼养蛋鸡骨质疏松症是一种在高产笼养蛋鸡群常见的骨代谢疾病，表现为骨骼脆性增加、骨骼强度和骨密度的下降。笼养蛋鸡骨质疏松症对蛋种鸡的影响更大，蛋种鸡平均人工授精1次/5-6天，每次抓取种鸡双腿进行人工授精，极易造成蛋种鸡骨折彻底丧失种用性能。此外，蛋鸡发生骨质疏松时不仅容易发生骨折，产蛋中后期的蛋壳品质也会显著下降引起破蛋率大大增加，还会造成产蛋率下降和死淘率增加，对蛋鸡养殖产业造成巨大的经济损失。许多手段已经被应用到笼养蛋鸡骨质疏松症防控方面，例如营养调控、加强运动和药物治疗等，但是这些手段尚未取得令人满意的效果。由于笼养蛋鸡骨质疏松症的发病之前无明显特征变化，且发病后难以恢复至正常水平。如果能更早期观测到发病的迹象，通过早干预、早预防等手段完全可以避免或延缓笼养蛋鸡骨质疏松症发生和发展，这对于蛋鸡养殖行业提高经济效益及动物福利方面具有重要的意义。作为一种快速出现的“组学”工具，代谢组学旨在定性和定量测量组织，细胞或生物体液中的小内源性代谢物，并作为诊断工具检测代谢状态的变化。代谢组学可以获取整体代谢谱并找到差异代谢物及相关代谢途径，然后进一步揭示该疾病的病理过程。代谢组学已广泛应用于代谢性疾病研究，是一种用于生物标志物鉴定和定量的可行而强大的工具。专利技术内容本专利技术的目的在于提供蛋鸡低骨密度联合诊断的血清代谢标志物，通过检测标志物的水平，可以预测蛋鸡低骨密度的风险，从而为笼养蛋鸡骨质疏松症的早期诊断和预防提供一种新的手段。为了实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一方面，本专利技术提供了一种筛选蛋鸡低骨密度联合诊断血清代谢标志物的方法，该方法包括以下步骤：步骤1，收集正常和低骨密度蛋鸡的血清或血浆样本；步骤2，采用液相色谱-质谱联用代谢组学方法对采集的样本进行分析，得到各样本的原始质谱数据；步骤3，使用代谢组学处理软件对原始质谱数据进行预处理，得到包含质荷比、保留时间和质谱峰强度/峰面积等代谢物信息的二维矩阵，用于下一步统计分析；步骤4，将步骤3中得到的二维矩阵依次进行主成分分析和正交-偏最小二乘法判别分析，得到多维统计分析OPLS-DA模型；步骤5，在多维统计分析OPLS-DA模型中应用不同的筛选标准，比如变量投影重要度大于1.0及单维统计分析的P值小于0.05，得到初步差异代谢物；步骤6，在步骤5得到的初步差异代谢物的基础上，结合初步差异代谢物的一级质谱信息、准分子离子信息、加合峰信息和同位素分布，计算差异代谢物的分子量和分子式，考察代谢物的二级质谱信息，与数据库上的比对确定其结构，部分代谢物进一步采用标准品进行确认；步骤7，对步骤6中确定的差异代谢物进行与蛋鸡骨密度的相关性分析，选取P值小于0.05的差异代谢物进行下一步分析；步骤8，对步骤7中P值小于0.05的差异代谢物进行受试者工作特征曲线(ROC)分析，选取曲线下面积大于0.80的作为候选血清代谢标志物。另一方面，本专利技术提供了一组用于蛋鸡低骨密度联合诊断血清代谢标志物，所述代谢标志物包括与骨密度正相关的七种代谢物，即牛磺酸(Taurine)、尿苷(Uridine)、棕榈酸(Palmiticacid)、肾上腺酸(AdrenicAcid)、非索非那定(Fexofenadine)、溶血磷脂酰胆碱(LysoPC(18:1))、溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPE(20:3/0:0))，以及与骨密度负相关的一种代谢物，即3-乙酰基-11-酮-β-乳香酸(3-Acetyl-11-keto-beta-boswellicacid)。第三方面，本专利技术还提供了一种非诊断目的检测蛋鸡血清或血浆中八种代谢标志物的方法，所述八种代谢标志物包括与骨密度正相关的七种代谢物，即牛磺酸(Taurine)、尿苷(Uridine)、棕榈酸(Palmiticacid)、肾上腺酸(AdrenicAcid)、非索非那定(Fexofenadine)、溶血磷脂酰胆碱(LysoPC(18:1))、溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPE(20:3/0:0))，以及与骨密度负相关的一种代谢物，即3-乙酰基-11-酮-β-乳香酸(3-Acetyl-11-keto-beta-boswellicacid)，所述检测方法包括将蛋鸡血清或血浆样本经提取后采用液相色谱-质谱联用进行分析的步骤。优选地，所述液相色谱的固定相为UPLCBEHAmide色谱柱，流动相A为25mM乙酸铵及25mM氨水混合溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，进样体积为2μL，流速为500μL/min。优选地，所述梯度洗脱程序如下：优选地，所述质谱的条件为：轰击能量：30eV，15张二级谱图每50ms，ESI离子源参数设置如下：雾化气压：60Psi，辅助气压：60Psi，气帘气压：35Psi，温度：600℃，喷雾电压：5000V(正离子模式)或-4000V(负离子模式)。本专利技术使用的术语“代谢标志物”或短的“标志物”被定义为蛋鸡体内的代谢过程中出现的代谢物或代谢化合物。“代谢标志物”或“标志物”通常在本专利技术的上下文中同义使用。本专利技术的优点和有益效果：本专利技术首次同时公开了与蛋鸡低骨密度正相关和负相关的八种代谢标志物，同时利用这八种与骨密度正相关和负相关的标志物，可以联合预测蛋鸡患骨质疏松的风险，从而为笼养蛋鸡骨质疏松症的早期诊断和预防提供一种新的手段，这对于蛋鸡养殖行业提高经济效益及动物福利方面具有重要的意义。附图说明图1为实施例1中正常对照组与低骨密度组老年笼养蛋鸡的股骨骨密度和胫骨骨密度(n＝5，)。图2为正常对照组与低骨密度组老年笼养蛋鸡血清代谢谱PCA和OPLS-DA分类图，其中图A是正离子模式下的PCA图，图B是负离子模式下的PCA图，图C是正离子模式下的OPLS-DA图，图D是负离子模式下的OPLS-DA图。图3为八种差异代谢物的相对定量，其中AKBA为3-乙酰基-11-酮-β-乳香酸。图4为八种差异代谢物的ROC分析。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均为本领域的常规方法。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域专业人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1筛选蛋鸡低骨密度联合诊断血清代谢标志物1、材料与试剂表1仪器表2试剂2、试验方法2.1样本的收集通过双能X射线骨密度仪测定老年笼养蛋鸡股骨和胫骨骨密度(图1)，选取正常和低骨密度笼养蛋鸡本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选蛋鸡低骨密度联合诊断血清代谢标志物的方法，其特征在于包括以下步骤：/n步骤1，收集正常骨密度和低骨密度蛋鸡的血清或血浆样本；/n步骤2，采用液相色谱-质谱联用代谢组学方法对采集的样本进行分析，得到各样本的原始质谱数据；/n步骤3，使用代谢组学处理软件对原始质谱数据进行预处理，得到包含质荷比、保留时间和质谱峰强度/峰面积等代谢物信息的二维矩阵，用于下一步统计分析；/n步骤4，将步骤3中得到的二维矩阵依次进行主成分分析和正交-偏最小二乘法判别分析，得到多维统计分析OPLS-DA模型；/n步骤5，在多维统计分析OPLS-DA模型中应用不同的筛选标准，比如变量投影重要度大于1.0及单维统计分析的P值小于0.05，得到初步差异代谢物；/n步骤6，在步骤5得到的初步差异代谢物的基础上，结合初步差异代谢物的一级质谱信息、准分子离子信息、加合峰信息和同位素分布，计算差异代谢物的分子量和分子式，考察代谢物的二级质谱信息，与数据库上的比对确定其结构，部分代谢物进一步采用标准品进行确认；/n步骤7，对步骤6中确定的差异代谢物进行与蛋鸡骨密度的相关性分析，选取P值小于0.05的差异代谢物进行下一步分析；/n步骤8，对步骤7中P值小于0.05的差异代谢物进行受试者工作特征曲线分析，选取曲线下面积大于0.80的作为候选血清代谢标志物。/n...

【技术特征摘要】
1.一种筛选蛋鸡低骨密度联合诊断血清代谢标志物的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1，收集正常骨密度和低骨密度蛋鸡的血清或血浆样本；
步骤2，采用液相色谱-质谱联用代谢组学方法对采集的样本进行分析，得到各样本的原始质谱数据；
步骤3，使用代谢组学处理软件对原始质谱数据进行预处理，得到包含质荷比、保留时间和质谱峰强度/峰面积等代谢物信息的二维矩阵，用于下一步统计分析；
步骤4，将步骤3中得到的二维矩阵依次进行主成分分析和正交-偏最小二乘法判别分析，得到多维统计分析OPLS-DA模型；
步骤5，在多维统计分析OPLS-DA模型中应用不同的筛选标准，比如变量投影重要度大于1.0及单维统计分析的P值小于0.05，得到初步差异代谢物；
步骤6，在步骤5得到的初步差异代谢物的基础上，结合初步差异代谢物的一级质谱信息、准分子离子信息、加合峰信息和同位素分布，计算差异代谢物的分子量和分子式，考察代谢物的二级质谱信息，与数据库上的比对确定其结构，部分代谢物进一步采用标准品进行确认；
步骤7，对步骤6中确定的差异代谢物进行与蛋鸡骨密度的相关性分析，选取P值小于0.05的差异代谢物进行下一步分析；
步骤8，对步骤7中P值小于0.05的差异代谢物进行受试者工作特征曲线分析，选取曲线下面积大于0.80的作为候选血清代谢标志物。


2.一组用于蛋鸡低骨密度联合诊断血清代谢标志物，其特征在于：所述代谢标志物包括与骨密度正相关的七种代谢物，即牛磺酸(Taurine)、尿苷(Uridine)、棕榈酸(Palmiticacid)、肾上腺酸(AdrenicAcid)、非索非那定(Fexofenadine)、溶血磷脂酰胆碱(LysoPC...

【专利技术属性】
技术研发人员：周忠新，黄杰，戴小方，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42