一种表观遗传的DAP-seq测序建库方法技术

本发明专利技术属于高通量测序建库领域，具体涉及一种表观遗传的DAP‑seq测序建库方法。本发明专利技术提供的测序建库方法主要包括载体构建、TF体外表达预实验及DAP‑seq建库等过程。本发明专利技术提供的测序建库方法可以直接使用从细胞中提取的基因组DNA与目标TF结合，从而可以保留基因组DNA修饰，与现有技术相比，更接近体内试验。

【技术实现步骤摘要】
一种表观遗传的DAP-seq测序建库方法
本专利技术属于高通量测序建库技术，具体涉及一种表观遗传的DAP-seq测序建库方法。
技术介绍
表观遗传学研究中，转录因子(TF，Transcriptionfactors)结合位点的发掘一直是难题，CHIP-seq是最有效的直接研究目标TF结合位点的技术。CHIP-seq通过特定的TF抗体，将与TF结合的DNA片段通过免疫共沉淀拉取下来，再通过高通量测序，就可以直接检测特定TF在基因组上的结合位点以及分析结合位点的motif(结合位点的特征序列)。但是CHIP-seq并非对所有的物种都适用，主要存在以下的一些难点：(1)抗体制备的难点：人、小鼠等这些常见模式物种的热门转录因子，通常有商业化的CHIP级抗体可以用，开展CHIP-seq还相对容易。但对于非热门转录因子或非模式物种，则无可用的商业化抗体。而制备CHIP级抗体难度大，周期长，是个完全不可控的过程；(2)替代方案的实验周期长：对于没有抗体的TF，一个替代方案就是构建重组蛋白，即在目标TF序列上接上flag标签序列或者GFP(绿色荧光蛋白)序列。然后通过转基因的手段，将重组后的TF序列导入到细胞或实验动物/植物体内，表达带有FLAG肽段或GFP标签的TF融合蛋白。然后利用FLAG或GFP的抗体，就可以实现目标TF的CHIP-seq。这种方案依然有一个不足：对于某些物种，转基因实验难度很大或周期很长，实验门槛依然很高。对于以上的CHIP-seq实验的不足，也存在一些体外实验的方法作为替代方案。比较有代表性的是指数富集的配体系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)和蛋白结合芯片(proteinbindingmicroarrays,PBM)。这两种方法都是人工合成DNA片段/探针库，然后在体外条件下与目标蛋白(TF)结合。通过对于目标蛋白结合的DNA序列进行检测，获得目标TF的结合位点信息。此类方法最大的不足是DNA均为人工合成，没有原始基因组DNA上的修饰信息(例如DNA甲基化)。而DNA甲基化等信息，是影响TF结合的重要因素，所以SELEX、PBM等方法很难还原TF在体内真实的结合情况，与CHIP-seq效果上还有较大差异。由此可知，现有技术中普遍存在效果差，破坏了原始基因组DNA上的修饰信息，难以还原TF在体内真实情况的缺点。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种表观遗传的DAP-seq测序建库方法。DAP-seq的全称是DNAaffinitypurificationsequencing(DNA亲和纯化测序)，本专利技术公开的DAP-seq测序建库方法，既可以开展体外实验，又可以得到更加接近体内实验(CHIP-seq)的效果。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种表观遗传的DAP-seq测序建库方法，包括如下步骤：S1、构建基因表达载体；S2、TF体外表达预实验；S3、DAP-seq建库。优选地，步骤S1的具体操作如下：(1)根据TF家族的基因序列，设计合成相关基因的引物，得TF引物；(2)用步骤S1获得的TF引物，通过PCR扩增TF基因；(3)利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，跑胶鉴定目的条带，回收含目标条带的琼脂糖凝胶，得含目标条带的PCR产物；(4)将步骤(3)所得含目标条带的PCR产物，用infusion连接方法，以pFN19KT7SP6Vector作为载体，进行载体连接；(5)取出感受态细胞于冰上解冻，得感受态细胞悬液；(6)向步骤(5)所得感受态细胞悬液中加入5μL的infusion连接产物及连接好的载体，于42℃热激60s，然后冰浴2min；(7)向每个离心管中加入液体培养基，37℃复苏DH5α大肠杆菌化学感受态细胞，然后于室温，6000rpm的条件下离心5min，去掉上清液，得重悬细菌；(8)将步骤(7)所得重悬细菌均匀涂在LB+Kan(卡那霉素Kanamycin，Kan，10mg/ml)固体培养基上，干燥后，倒置平板，37℃过夜培养；(9)挑选单克隆菌，并分别接菌于LB+Kan(卡那霉素Kanamycin，Kan，10mg/ml)液体培养基中，37℃摇菌，至肉眼可见的浑浊；(10)鉴定阳性克隆菌，并通过1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带，挑选出阳性单克隆菌；(11)将步骤(10)挑选出的阳性单克隆菌接种于液体培养基中，37℃过夜培养，然后通过提取构建好的目的TF的重组表达质粒，进行PCR鉴定并测序，挑选出与目标序列一致的单克隆菌，即得。优选地，步骤(4)中的pFN19KT7SP6Vector质粒是用致死基因ccdb替换了原有的致死基因barnase，同时在ccdb两端引入HindIII和EcoRV两个酶切位点，改进获得的。优选地，步骤(7)，步骤(9)及步骤(11)中的液体培养基为LB液体培养基；步骤(8)中的固体培养基为LB固体培养基。优选地，步骤S2的具体操作过程如下：(1)配制5μL的反应体系，25℃金属浴2h；(2)制备page胶，每个孔加1μL样品，进行电泳；(3)用甲醇提前预处理8.5cm×4.0cm的PVDF膜，备用；(4)将电泳完毕的凝胶去除浓缩胶后，放入8.5cm×4.0cm的PVDF膜，膜转移buffer中，平衡5min；(5)在胶黑膜白的前提下，放入转膜槽中转膜；(6)小心将PVDF膜取出，正面朝上，加入适量封闭液；(7)一抗溶于封闭液，混匀后，加在8.5cm×4.0cm的PVDF膜上，孵育60min；(8)二抗溶于封闭液，混匀后，加在8.5cm×4.0cm的PVDF膜上，孵育60min；(9)将PVDF膜正面朝上，加入1mL的ThermoScientificSuperSignalWestPicoPLUSChemiluminescentSubstrate作为荧光底物，于25℃的条件下反应2min，然后将PVDF膜放入暗盒，加入显影胶片；(10)在暗室中曝光、显影、定影，将底片在自来水下冲洗干净后，烘干，保存，分析结果，若TF能正常体外表达，即可。优选地，步骤(1)中的5μL的反应体系包括：3μL的SP6High-YieldWheatGermMasterMix和2μL的目的质粒。优选地，步骤(7)中的一抗指Anti-HaloTagMonoClonalantibody，步骤(8)中的二抗指GoatAnti-MouseIgG(H+L)HRPConjugate。优选地，步骤S3的具体操作过程为：(1)将DNA用超声打断，然后用磁珠分选DNA片段，得分选后的DNA片段；(2)在步骤(1)所得分选后的DNA片段末端修复加A，同时加接头，得构建好的DNA文库；(3)体外表达带有ha本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表观遗传的DAP-seq测序建库方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、构建基因表达载体；/nS2、TF体外表达预实验；/nS3、DAP-seq建库。/n

【技术特征摘要】
1.一种表观遗传的DAP-seq测序建库方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、构建基因表达载体；
S2、TF体外表达预实验；
S3、DAP-seq建库。


2.如权利要求1所述表观遗传的DAP-seq测序建库方法，其特征在于，步骤S1的具体操作如下：
(1)根据TF家族的基因序列，设计合成相关基因的引物，得TF引物；
(2)用步骤S1获得的TF引物，通过PCR扩增TF基因；
(3)利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，跑胶鉴定目的条带，回收含目标条带的琼脂糖凝胶，得含目标条带的PCR产物；
(4)将步骤(3)所得含目标条带的PCR产物，用infusion连接方法，以pFN19KT7SP6Vector作为载体，进行载体连接；
(5)取出感受态细胞于冰上解冻，得感受态细胞悬液；
(6)向步骤(5)所得感受态细胞悬液中加入5μL的infusion连接产物及连接好的载体，于42℃热激60s，然后冰浴2min；
(7)向每个离心管中加入液体培养基，37℃复苏DH5α大肠杆菌化学感受态细胞，然后于室温，6000rpm的条件下离心5min，去掉上清液，得重悬细菌；
(8)将步骤(7)所得重悬细菌均匀涂在LB+Kan(卡那霉素Kanamycin，Kan，10mg/ml)固体培养基上，干燥后，倒置平板，37℃过夜培养；
(9)挑选单克隆菌，并分别接菌于LB+Kan(卡那霉素Kanamycin，Kan，10mg/ml)液体培养基中，37℃摇菌，至肉眼可见的浑浊；
(10)鉴定阳性克隆菌，并通过1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带，挑选出阳性单克隆菌；
(11)将步骤(10)挑选出的阳性单克隆菌接种于液体培养基中，37℃过夜培养，然后通过提取构建好的目的TF的重组表达质粒，进行PCR鉴定并测序，挑选出与目标序列一致的单克隆菌，即得。


3.如权利要求2所述表观遗传的DAP-seq测序建库方法，其特征在于，步骤(4)中的pFN19KT7SP6Vector质粒是用致死基因ccdb替换了原有的致死基因barnase，同时在ccdb两端引入HindIII和EcoRV两个酶切位点，改进获得的。


4.如权利要求2所述表观遗传的DAP-seq测序建库方法，其特征在于，步骤(7)，步骤(9)及步骤(11)中的液体培养基为LB液体培养基；步骤(8)中的固体培养基为LB固体培养基。


5.如权利要求1所述表观遗传的DAP-seq测序建库方法，其特征在于，步骤S2的具体操作过程如下：
(1)配制5μL的反应体系，25℃金属浴2...

【专利技术属性】
技术研发人员：周煌凯，夏昊强，高川，艾鹏，陈飞钦，张东东，张秋雪，
申请(专利权)人：广州基迪奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44