一种肉毒毒素抗原蛋白、重组载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种肉毒毒素抗原蛋白BoNT‑Ag，所述抗原蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO:2，编码该肉毒毒素抗原蛋白的基因优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明专利技术还公开表达该抗原蛋白的重组载体、宿主菌，并进一步公开了该抗原蛋白的分离纯化方法和应用。采用本发明专利技术所述方法制备的抗原蛋白可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答，可作为肉毒毒素疫苗的候选抗原。

A botulinum toxin antigen protein, recombinant vector and its application

【技术实现步骤摘要】
一种肉毒毒素抗原蛋白、重组载体及其应用
本申请涉及生物制药和多肽合成
，具体涉及一种用于制备肉毒毒素疫苗的候选抗原蛋白和重组载体，以及该抗原蛋白在制备肉毒毒素重组蛋白疫苗中的应用。
技术介绍
肉毒毒素是由肉毒杆菌所分泌的一种神经毒素，是目前已知毒性最强的蛋白毒素，被国际上列为重要的生物毒素战剂，也是恐怖分子最有可能使用的生物恐怖剂之一。肉毒毒素小鼠LD50为0.00625ng，少至0.1～1.0μg的肉毒毒素就可导致人中毒死亡。该毒素可分为7型，其中我国肉毒杆菌食物中毒大多是由A型引起的。结构研究表明：肉毒毒素由轻链(L链，50KDa)与重链(H链，100KDa)通过一个二硫键连接而成。轻链是毒性亚单位，与肉毒毒素毒性密切相关，而重链与肉毒毒素的受体特异结合有关，其羧基端分子量约50KDa的片段(HC)是肉毒毒素的受体结合区(KTurton,etal.TrendsinBiochemicalSciences，2002)，目前认为肽段729–747,757–775和799–817中的某些氨基酸残基参与了受体的结合(BVAyyar,etal.BBA,2016)。毒素与受体结合后，位于重链N端的毒素转运区域构象发生变化，在宿主细胞膜上形成离子通道，L链通过此通道进入胞液。在胞内，毒素分解底物蛋白释放乙酰胆碱，导致肌肉松弛或痉挛麻痹。重链HC段与受体的结合是毒素发挥活性的前提，一旦毒素与神经细胞受体结合后，抗体就不能中和毒素(MAHanson,etal.NatStructBiol,2000)，因此通过疫苗免疫或抗体治疗阻断毒素与受体的结合是防治肉毒中毒的有效医学措施。研究表明肉毒毒素具有很强的免疫原性和抗原性，而HC片段是肉毒毒素的主要保护性抗原，含有中和性B细胞表位(MTDertzbaugh,etal.Vaccine，1996)。A型肉毒毒素重链全长1296个氨基酸，分子量过大难以实现全长蛋白的可溶表达，目前也没有成功的先例，现有研究也对重链的某些区域进行了表达用于疫苗研究，如HC873-1296，HC1096-1296等(MTavallaiea,etal.FEBSLett，2004)，但这些片段不含关键的受体结合区。
技术实现思路
本申请通过对毒素晶体结构(BZDolimbek,Immunobiology,2011)的分析，对密码子、表达系统和载体等的优化，获得了其718-1132片段(BoNT-Ag，SEQIDNO:2)的高效可溶表达，该片段包含了所有的受体结合位点，且包含了HC端的高免疫原性区域。在表达的基础上通过亲和层析和分子筛层析两步纯化得到了高纯度的抗原蛋白，动物实验表明BoNT-Ag具有良好的免疫原性，能够诱导高效的体液免疫应答，可作为有效的疫苗候选抗原。基于上述研究本专利技术提供一种肉毒毒素重组蛋白抗原BoNT-Ag，其可应用于肉毒毒素亚单位疫苗的制备。为实现上述目的，本专利技术提供一种肉毒毒素抗原蛋白，所述肉毒毒素抗原蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2。全长的肉毒毒素重链分子量较大，无法在大肠杆菌中进行重组表达。因此，本专利技术在系统分析A型肉毒毒素重链的氨基酸组成、受体结合位点和B/T细胞表位分布，并参考其晶体结构的基础上，通过大量的摸索和尝试，最终发现718-1132片段可以在大肠杆菌中得到高效表达，该片段包含了所有的受体结合位点，且包含了HC端的高免疫原性区域，安全无毒，是理想的疫苗候选抗原。本专利技术将该片段命名为BoNT-Ag，其氨基酸序列为SEQIDNO:2:LeuAlaLysValAsnThrGlnIleAspLeuIleArgLysLysMetLysGluAlaLeuGluAsnGlnAlaGluAlaThrLysAlaIleIleAsnTyrGlnTyrAsnGlnTyrThrGluGluGluLysAsnAsnIleAsnPheAsnIleAspAspLeuSerSerLysLeuAsnGluSerIleAsnLysAlaMetIleAsnIleAsnLysPheLeuAsnGlnCysSerValSerTyrLeuMetAsnSerMetIleProTyrGlyValLysArgLeuGluAspPheAspAlaSerLeuLysAspAlaLeuLeuLysTyrIleTyrAspAsnArgGlyThrLeuIleGlyGlnValAspArgLeuLysAspLysValAsnAsnThrLeuSerThrAspIleProPheGlnLeuSerLysTyrValAspAsnGlnArgLeuLeuSerThrPheThrGluTyrIleLysAsnIleIleAsnThrSerIleLeuAsnLeuArgTyrGluSerAsnHisLeuIleAspLeuSerArgTyrAlaSerLysIleAsnIleGlySerLysValAsnPheAspProIleAspLysAsnGlnIleGlnLeuPheAsnLeuGluSerSerLysIleGluValIleLeuLysAsnAlaIleValTyrAsnSerMetTyrGluAsnPheSerThrSerPheTrpIleArgIleProLysTyrPheAsnSerIleSerLeuAsnAsnGluTyrThrIleIleAsnCysMetGluAsnAsnSerGlyTrpLysValSerLeuAsnTyrGlyGluIleIleTrpThrLeuGlnAspThrGlnGluIleLysGlnArgValValPheLysTyrSerGlnMetIleAsnIleSerAspTyrIleAsnArgTrpIlePheValThrIleThrAsnAsnArgLeuAsnAsnSerLysIleTyrIleAsnGlyArgLeuIleAspGlnLysProIleSerAsnLeuGlyAsnIleHisAlaSerAsnAsnIleMetPheLysLeuAspGlyCysArgAspThrHisArgTyrIleTrpIleLysTyrPheAsnLeuPheAspLysGluLeuAsnGluLysGluIleLysAspLeuTyrAspAsnGlnSerAsnSerGlyIleLeuLysAspPheTrpGlyAspTyrLeuGlnTyrAspLysProTyrTyrMetLeuAsnLeuTyrAspProAsnLysTyrValAspValAsnAsnValGlyIleArgGly。本专利技术还提供了上述肉毒毒素抗原蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1。为增加BoNT-Ag在大肠杆菌工程菌内的表达量，本专利技术优化了其DNA编码序列，优化后的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术还提供了一种用于表达肉毒毒素抗原蛋白的重组载体，所述重组载体包含上述的肉毒毒素抗原蛋白的编码基因。在根据本专利技术的一个实施方案中，在重组载体中所述肉毒毒素抗原蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肉毒毒素抗原蛋白，其特征在于，所述肉毒毒素抗原蛋白的氨基酸序列为SEQID NO:2。/n

【技术特征摘要】
1.一种肉毒毒素抗原蛋白，其特征在于，所述肉毒毒素抗原蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2。


2.权利要求1所述的肉毒毒素抗原蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1。


3.一种用于表达肉毒毒素抗原蛋白的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如权利要求1所述的肉毒毒素抗原蛋白的编码基因。


4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述肉毒毒素抗原蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1。


5.如权利要求3或4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的骨架质粒中包含标签蛋白表达序列。


6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述标签蛋白为组氨酸标签。


7.如权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述组氨酸标签为在表达后连接在肉毒毒素抗原蛋白的C-端。


8.一种用于表达肉毒毒素抗原蛋白的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌为表达如权利要求3-7中任一项所述的重组载体的原核细菌，所述原核细菌优选为大肠杆菌，更优选地为大肠杆菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：章金勇，罗萍，程平，敬海明，庄园，邹全明，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50