【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备寡核苷酸化合物的方法相关申请的交叉引用本申请要求2017年7月28日提交的美国临时申请号62/538,504的优先权权益。前述相关申请的全部内容以引用方式并入本文。1.
本申请涉及包含寡核苷酸、特别是Smad7反义寡核苷酸的组合物以及制备所述组合物的方法。2.
技术介绍
寡核苷酸可用于多种生物学和生化应用中。例如，寡核苷酸可用于药物探索和开发中、用于诊断测试中、用作研究剂(诸如聚合酶链式反应(PCR)中的引物或探针)、用作靶标验证中的反义剂、用作转录因子的竞争性抑制剂、用作核酶、用作适体、用作免疫系统的刺激物或，或用作治疗疾病的生物治疗剂。因此，对寡核苷酸的增加的需求和使用已经导致对用于以越来越大的数千克规模合成具有GMP品质的寡核苷酸的快速、廉价且有效的方法的需求日益增长。Mongersen(以前称为GED-0301)是一种21碱基的单链硫代磷酸酯寡核苷酸，其可与人SMAD7信使RNA(mRNA)杂交。Monteleone等人，2015,NEJM372:1104-1113。在2期临床研究中，接受mongersen的克罗恩氏病参与者的缓解率和临床反应率明显高于接受安慰剂的参与者。Monteleone等人，2015,NEJM372:1104-1113。Mongersen是序列为5'-GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3'的21碱基寡核苷酸。硫代磷酸酯化学反应包括在每个核苷酸间键中将非键合氧替换为硫原子。通过5-甲基化修饰核苷酸位置3和16处的胞嘧啶残基。制备天然存在的寡核苷...
【技术保护点】
1.单批寡核苷酸组合物，所述单批寡核苷酸组合物包含至少700mmol的所述寡核苷酸和至多25重量％的水；其中所述寡核苷酸具有以下核酸序列：/nSEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，/n其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170728 US 62/538,5041.单批寡核苷酸组合物，所述单批寡核苷酸组合物包含至少700mmol的所述寡核苷酸和至多25重量％的水；其中所述寡核苷酸具有以下核酸序列：
SEQIDNO:3：(5'-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
2.单批寡核苷酸组合物，所述单批寡核苷酸组合物包含至少2g/mmol的合成规模为至少700mmol的所述寡核苷酸和至多25重量％的水；其中所述寡核苷酸具有以下核酸序列：
SEQIDNO:3：(5'-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
3.单批寡核苷酸组合物，所述单批寡核苷酸组合物包含至少2kg的所述寡核苷酸和至多25重量％的水；其中所述寡核苷酸具有以下核酸序列：
SEQIDNO:3：(5'-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
4.单批寡核苷酸组合物，所述单批寡核苷酸组合物包含至少50mol％的来自至少一个700mmol或更大的寡核苷酸合成柱的所述寡核苷酸输出，以及至多25重量％的水；其中所述寡核苷酸具有以下核酸序列：
SEQIDNO:3：(5'-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
5.如权利要求1-4中任一项所述的单批寡核苷酸组合物，其中所述寡核苷酸的核苷酸间键中的至少一个是O,O-连接的硫代磷酸酯。
6.如权利要求1-5中任一项所述的单批寡核苷酸组合物，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸间键都是O,O-连接的硫代磷酸酯。
7.一种寡核苷酸的基本上纯的寡核苷酸组合物，其中5'-末端核苷的5'-羟基被保护；其中所述寡核苷酸具有以下核酸序列：
SEQIDNO:3：(5'-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
8.如权利要求7所述的基本上纯的寡核苷酸组合物，其中仅所述5'-末端核苷的5'-羟基被保护。
9.如权利要求8所述的基本上纯的寡核苷酸组合物，其中所述受保护的寡核苷酸是在从合成柱上切割并洗脱后获得的。
10.如权利要求7-9中任一项所述的基本上纯的寡核苷酸组合物，其中所述组合物的纯度是60％或更高。
11.如权利要求7-10中任一项所述的基本上纯的寡核苷酸组合物，其中所述寡核苷酸的所述核苷酸间键中的至少一个是O,O-连接的硫代磷酸酯。
12.如权利要求7-11中任一项所述的基本上纯的寡核苷酸组合物，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸间键都是O,O-连接的硫代磷酸酯。
13.如权利要求1-6中任一项所述的单批寡核苷酸组合物或如权利要求7-12中任一项所述的基本上纯的寡核苷酸组合物，其中所述寡核苷酸是根据包括以下步骤的方法制备的：
a)提供连接到固体支撑物的接头，其中所述接头包含受保护的羟基；
b)使所述接头的所述受保护的羟基脱保护，从而产生脱保护的羟基；
c)独立地提供核苷亚磷酰胺，其中所述核苷亚磷酰胺包含受保护的羟基和受保护的亚磷酰胺；
d)将所述核苷亚磷酰胺独立地偶联至所述接头的所述脱保护的羟基，或至来自所述反应循环的所述先前迭代的所述核苷的所述脱保护的羟基，从而产生亚磷酸三酯连接的核苷；
e)独立地硫醇化所述受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的硫代磷酸酯键；
f)任选地，对未反应的脱保护的羟基独立地加帽；
g)任选地，使所述核苷的所述受保护的羟基独立地脱保护；
h)重复所述提供、偶联、硫醇化、加帽和脱保护步骤(步骤c)至g))达预定次数以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸；
i)使所述受保护的硫代磷酸酯键脱保护；
j)从所述固体支撑物上切割所述寡核苷酸；
k)从所述固体支撑物上洗脱所述寡核苷酸；
l)使用离子交换色谱柱纯化所述寡核苷酸洗脱物；以及
m)使用薄膜蒸发浓缩所述寡核苷酸化合物的溶液。
14.如权利要求13所述的寡核苷酸组合物，其中所述纯化步骤l)包括：
1)将来自洗脱步骤k)的所述寡核苷酸洗脱物加载到所述离子交换色谱柱上；
2)使来自所述末端核苷的所述受保护的羟基脱保护；以及
3)使用盐梯度从所述离子交换色谱柱上洗脱所述寡核苷酸。
15.如权利要求13所述的寡核苷酸组合物，其中所述纯化步骤l)包括：
1)将来自洗脱步骤k)的所述寡核苷酸洗脱物加载到所述离子交换色谱柱上；
2)使来自末端核苷的受保护的羟基脱保护；
3)使用盐梯度从离子交换色谱柱洗脱所述寡核苷酸；以及
4)经由超滤和/或渗滤使来自所述离子交换柱的所述寡核苷酸洗脱物脱盐。
16.如权利要求13-15中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中所述连接有接头的固体支撑物是交联聚苯乙烯。
17.如权利要求13-16中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中所述未反应的脱保护的羟基被用酰基加帽。
18.如权利要求13-17中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中所述未反应的脱保护羟基的加帽包括添加：
a)第一加帽溶液(CapA)，所述第一加帽溶液包含N-甲基咪唑(NMI)、吡啶和乙腈；以及
b)第二加帽溶液(CapB)，所述第二加帽溶液包含加帽剂和乙腈。
19.如权利要求18所述的寡核苷酸组合物，其中所述加帽剂是异丁酸酐。
20.如权利要求13-19中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中所述硫醇化剂是氢化黄原素(XH)。
21.如权利要求13-20中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中所述切割所述脱保护的与固体支撑物结合的寡核苷酸包括提供氢氧化铵溶液。
22.如权利要求13-21中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中所述离子交换色谱是阴离子交换色谱。
23.如权利要求13-22中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中将所述寡核苷酸洗脱物用碱性水溶液加载到所述离子交换色谱柱上。
24.如权利要求13-23中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中用80％乙酸水溶液使所述离子交换色谱柱上的所述加载的寡核苷酸洗脱物的所述5'-羟基保护基脱保护。
25.如权利要求13-24中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中用碱性盐梯度从离子交换色谱柱上洗脱所述完全脱保护的寡核苷酸。
26.如权利要求13-25中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中经由超滤和/或渗滤工艺使所述完全脱保护的寡核苷酸脱盐。
27.如权利要求13-26中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中所述超滤和/或渗滤工艺利用pH在5-8范围内的水。
...
【专利技术属性】
技术研发人员：安东尼·弗兰克，凯文·克洛普弗，小唐纳德·约瑟夫·加拉格尔，拉蕾·贾法普尔，
申请(专利权)人：细胞基因公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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