免疫突触的变体文库及其合成制造技术

本文公开了用于生成编码核酸序列预定变体的高度准确的核酸文库的方法。该核酸序列可编码CAR的参考结构域的全部或部分。变异程度可以是完全的，从而产生饱和的变体文库，或者变异程度可以是不完全的，从而产生非饱和的变体文库。本文所述的变异核酸文库可被设计用于通过转录或翻译进一步加工。本文所述的变异核酸文库可被设计用来生成变异RNA、DNA和/或蛋白质群体。本文进一步提供了用于鉴定具有增加或降低活性的变异种类的方法，其应用于调节用于治疗或减轻疾病如癌症的治疗剂的生物学功能及设计。

Variant Library of immune synapse and its synthesis

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】免疫突触的变体文库及其合成交叉引用本申请要求2017年3月15日提交的第62/471,810号美国临时专利申请的权益，该美国临时专利申请通过引用整体并入本文。序列表本申请含有以ASCII格式电子提交的序列表，并且其通过引用整体并入本文。创建于2018年3月9日的所述ASCII副本被命名为44854-733_601_SL.txt，大小为19,476个字节。
技术介绍
合成生物学的基石是设计、构建和测试过程——一个需要DNA，以使得便于快速且可行地生成并优化这些定制途径和生物体的迭代过程。在设计阶段，将构成DNA的A、C、T和G核苷酸规划成包含感兴趣的基因座或途径的多种基因序列，其中每种序列变体代表将进行测试的特定假设。这些变异基因序列代表序列空间(起源于进化生物学的一个概念)的子集，并且从属于构成基因、基因组、转录物组和蛋白质组的全部序列。通常针对每个设计-构建-测试循环设计许多不同的变体，以实现对序列空间的充分采样并使优化设计的可能性最大化。尽管在概念上很简单，但与常规合成方法的速度、通量和质量相关的工艺瓶颈阻碍了这一循环进展的步伐，从而延长了开发时间。由于极其准确的DNA的高成本和当前合成技术的有限通量导致无法充分探索序列空间仍然是限速步骤。从构建阶段开始，有两个过程值得注意：寡核苷酸合成和基因合成。以往，通过分子克隆实现不同基因变体的合成。这种方法虽然稳定，但无法放大。早期的化学基因合成工作集中于产生大量具有重叠序列同源性的寡核苷酸。随后将这些寡核苷酸合并，并经历多轮聚合酶链反应(PCR)，从而使重叠的寡核苷酸连接成全长双链基因。许多因素阻碍了这一方法，包括构建耗时耗力、需要大量的亚磷酰胺、原材料昂贵以及产生纳摩尔量的最终产物(显著低于下游步骤所需的量)，并且大量单独的寡核苷酸需要一个96孔板来建立一个基因的合成。在微阵列上合成寡核苷酸使得基因合成的通量显著增加。可以在微阵列表面上合成大量的寡核苷酸，然后切下并合并在一起。针对特定基因的每种寡核苷酸含有独特的条形码序列，该条形码序列能够使特定的寡核苷酸亚群区分开(depooled)并装配成感兴趣的基因。在该过程的这个阶段，将每个子池转移至96孔板中的一个孔中，从而使通量增加到96个基因。虽然其通量比经典方法高两个数量级，但由于缺乏成本效益且周转时间缓慢，它仍然不能充分支持一次需要数千个序列的设计、构建、测试循环。因此，对变异序列文库的更有效生成存在需求。免疫系统具有寻找并摧毁有害细胞的能力。T细胞在这样的过程中起重要作用。因此，包含遗传修饰的T细胞以促使免疫系统识别并消除恶性细胞的疗法是可用于治疗疾病如癌症的备选疗法。特别是，可以设计表达嵌合抗原受体(CAR)的遗传修饰的T细胞，以靶向诸如癌细胞等有害细胞。然而，由于CAR疗法能够引起不良作用，如在靶脱肿瘤(on-targetoff-tumor)毒性、自身免疫性、宿主-移植物毒性，且有时引起死亡，因此还需要进一步优化。因此，对用于利用CAR疗法的癌症治疗的改进组合物和方法存在需求。援引并入本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入本文，其程度犹如具体地和个别地指出每一单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
技术实现思路
本文提供了核酸文库，其中该核酸文库包含至少10,000个核酸，其中每个核酸编码参考序列的预选变体，该参考序列编码嵌合抗原受体或其功能域。本文还提供了核酸文库，其中所述嵌合抗原受体的功能域包括抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域。本文还提供了核酸文库，其中该文库包含至少1,000,000个核酸。本文还提供了核酸文库，其中每个核酸的长度为100个碱基至2000个碱基。本文还提供了核酸文库，其中每个核酸均附接至载体序列。本文还提供了核酸文库，其中所述载体序列是病毒载体序列。本文提供了核酸文库，其中该核酸文库包含多个核酸，其中每个核酸编码参考序列的预选变体，该参考序列编码嵌合抗原受体或其功能域，其中所述多个核酸包含所述参考序列中的至少两个位置的所有变异，并且其中所述至少两个位置编码来自5至20个不同密码子的序列。本文还提供了核酸文库，其中所述嵌合抗原受体的功能域包括抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域。本文还提供了核酸文库，其中所述多个核酸包含所述参考序列中的2、3、4或5个位置的所有变异。本文还提供了核酸文库，其中所述至少两个位置编码来自10至20个不同密码子的序列。本文还提供了核酸文库，其中所述至少两个位置编码约10个不同密码子的序列。本文还提供了核酸文库，其中每个核酸的长度为100个碱基至2000个碱基。本文提供了寡核苷酸文库，该寡核苷酸文库包含至少10,000个寡核苷酸，其中每个寡核苷酸编码参考序列的预选变体，该参考序列编码嵌合抗原受体的区域，其中该区域包含抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域的一部分。本文还提供了寡核苷酸文库，其中该文库包含至少1,000,000个寡核苷酸。本文还提供了寡核苷酸文库，其中每个寡核苷酸的长度为12至500个碱基。本文还提供了寡核苷酸文库，其中每个寡核苷酸都附接至载体序列。本文提供了寡核苷酸文库，其中该寡核苷酸文库包含多个寡核苷酸，其中每个寡核苷酸编码参考序列的预选变体，该参考序列编码嵌合抗原受体的区域，其中该区域包含抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域的一部分，其中每个寡核苷酸的长度为至少12个碱基，其中所述多个寡核苷酸包含所述参考序列中的至少两个位置的所有变异，并且其中所述至少两个位置编码来自5至20个不同密码子的序列。本文还提供了寡核苷酸文库，其中所述多个寡核苷酸包含2、3、4或5个位置的所有变异。本文还提供了寡核苷酸文库，其中所述至少两个位置编码来自10至20个不同密码子的序列。本文还提供了寡核苷酸文库，其中所述至少两个位置编码约10个不同密码子的序列。本文还提供了寡核苷酸文库，其中每个寡核苷酸的长度为12至500个碱基。本文提供了包含至少400个核酸的核酸文库，其中所述至少400个核酸中的第一多个核酸编码参考序列的变体，该参考序列编码抗原识别域，并且其中所述至少400个核酸中的第二多个核酸编码参考序列的变体，该参考序列编码嵌合抗原受体(CAR)的铰链域、跨膜域或胞内域。本文还提供了核酸文库，其中每个核酸的长度为至少100个碱基。本文还提供了核酸文库，其中每个核酸的长度为100至2000个碱基。本文还提供了核酸文库，其中所述至少400个核酸中的第一多个核酸包含所述参考序列中的至少两个位置的所有变异。本文还提供了核酸文库，其中所述至少400个核酸中的第一多个核酸包含所述参考序列中的2、3、4或5个位置的所有变异。本文还提供了核酸文库，其中所述至少400个核酸中的第二多个核酸包含所述参考序列中的至少两个位置的所有变异。本文还提供了核酸文库，其中所述至少400个核酸中的第二多个核酸包含参考序列中的2、3、4或5个位置的所有变异。本文还提供了核酸文库，其中所述至少两个位置编码来自5至20个不同密码子的序列。本文还提供了核酸文库，其中所述至少两个位置编码来自10至20个不同密码子的序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸文库，所述核酸文库包含至少10,000个核酸，其中每个核酸编码参考序列的预选变体，该参考序列编码嵌合抗原受体或其功能域。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170315 US 62/471,8101.一种核酸文库，所述核酸文库包含至少10,000个核酸，其中每个核酸编码参考序列的预选变体，该参考序列编码嵌合抗原受体或其功能域。


2.根据权利要求1所述的核酸文库，其中所述嵌合抗原受体的功能域包括抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域。


3.根据权利要求1所述的核酸文库，其中所述文库包含至少1,000,000个核酸。


4.根据权利要求1所述的核酸文库，其中每个核酸的长度为100个碱基至2000个碱基。


5.根据权利要求1所述的核酸文库，其中每个核酸均附接至载体序列。


6.根据权利要求5所述的核酸文库，其中所述载体序列是病毒载体序列。


7.一种核酸文库，所述核酸文库包含多个核酸，其中每个核酸编码参考序列的预选变体，该参考序列编码嵌合抗原受体或其功能域，其中所述多个核酸包含所述参考序列中的至少两个位置的所有变异，并且其中所述至少两个位置编码来自5至20个不同密码子的序列。


8.根据权利要求7所述的核酸文库，其中所述嵌合抗原受体的功能域包括抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域。


9.根据权利要求7所述的核酸文库，其中所述多个核酸包含所述参考序列中的2、3、4或5个位置的所有变异。


10.根据权利要求7所述的核酸文库，其中所述至少两个位置编码来自10至20个不同密码子的序列。


11.根据权利要求7所述的核酸文库，其中所述至少两个位置编码约10个不同密码子的序列。


12.根据权利要求7所述的核酸文库，其中每个核酸的长度为100个碱基至2000个碱基。


13.一种寡核苷酸文库，所述寡核苷酸文库包含至少10,000个寡核苷酸，其中每个寡核苷酸编码参考序列的预选变体，该参考序列编码嵌合抗原受体的区域，其中所述区域包含抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域的一部分。


14.根据权利要求13所述的寡核苷酸文库，其中所述文库包含至少1,000,000个寡核苷酸。


15.根据权利要求13所述的寡核苷酸文库，其中每个寡核苷酸的长度为12至500个碱基。


16.根据权利要求13所述的寡核苷酸文库，其中每个寡核苷酸均附接至载体序列。


17.一种寡核苷酸文库，所述寡核苷酸文库包含多个寡核苷酸，其中每个寡核苷酸编码参考序列的预选变体，该参考序列编码嵌合抗原受体的区域，其中所述区域包含抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域的一部分，其中每个寡核苷酸的长度为至少12个碱基，其中所述多个寡核苷酸包含所述参考序列中的至少两个位置的所有变异，并且其中所述至少两个位置编码来自5至20个不同密码子的序列。


18.根据权利要求17所述的寡核苷酸文库，其中所述多个寡核苷酸包含2、3、4或5个位置的所有变异。


19.根据权利要求17所述的寡核苷酸文库，其中所述至少两个位置编码来自10至20个不同密码子的序列。


20.根据权利要求17所述的寡核苷酸文库，其中所述至少两个位置编码约10个不同密码子的序列。
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【专利技术属性】
技术研发人员：安东尼·考克斯，陈思远，
申请(专利权)人：特韦斯特生物科学公司，
类型：发明
国别省市：美国;US