MDM-2及其干扰序列在制备逆转非小细胞肺癌对吉非替尼耐药药物中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，特别MDM2作为标志物预测吉非替尼耐药性以及MDM‑2干扰序列在制备逆转非小细胞肺癌对吉非替尼耐药药物中的应用；通过合成MDM2特异性的干扰序列，应用RNA抗干扰技术下调耐吉非替尼的肺癌细胞中MDM2的蛋白表达水平可以起到逆转肺癌细胞对吉非替尼耐药的作用。

【技术实现步骤摘要】
MDM-2及其干扰序列在制备逆转非小细胞肺癌对吉非替尼耐药药物中的应用
本专利技术属于基因工程领域，特别涉及MDM-2干扰序列在制备逆转非小细胞肺癌对吉非替尼耐药药物中的应用。
技术介绍
肺癌是目前世界上罹患癌症的男性和女性中导致死亡的最主要的病因，非小细胞肺癌(Nonsmallcelllungcancer,NSCLC)占据了所有肺癌患者的85％。目前在全球范内非小细胞肺癌每年的新增病例及死亡人数都在不断的攀升，也广大的医务工作人员也带来了严峻的考验。而治愈性的手术切除通常只适用于早期发病。各种分期的肺癌五年生存率只有15％。对于检查出的疾病为局限期的患者来说，生存率也仅为49％，这说明，即使是早期的诊断，该疾病的复发和死亡也是很普遍的，因此，为肺癌患者寻找新的治疗方法十分关键。吉非替尼是一种可逆性小分子酪氨酸激酶抑制剂，结构与ATP类似，通过与ATP竞争可逆性的与EGFR结合，达到阻断其下游信号通路的目的，目前已经被多个国家批准用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)。酪氨酸激酶催化下游分子磷酸化，随即启动一系列下游的信号通路，包括PLCγ、PI3K、小的G蛋白、P21ras、rasGTP酶激活蛋白(GAP)、生长因子受体结合蛋白2(grb2)和src激酶家族等。其中研究较明确的主要有两条途径：一条是ras/erk/MAPK途径。另一条是PI3K-AKT-PKC-IKK途径，导致NFκB移位至核内，而将信息传递入细胞核。EGFR活化后经过上述信号传导途径最终引起一系列相关基因活化，导致肿瘤细胞持续增殖，凋亡抑制，以及包括血管形成因子在内的多种细胞因子合成，促使肿瘤细胞转移并导致放化疗抗拒。对于EGFR突变型的非小细胞肺癌患者有着较高的有效率，并且由于其毒性反应低，耐受性良好已经成为非小细胞肺癌治疗最有力武器之一，但是多数患者在使用吉非替尼一段时间后(通常为8-10个月)会出现疾病再次进展，根本原因是由于肿瘤细胞由于长期暴露于吉非替尼后产生了对吉非替尼的获得性耐药，目前已知的两种肺癌吉非替尼获得性耐药的重要机制是“EGFR19外显子缺失且发生T790M突变或其他继发性突变”和“Met扩增旁路激活通路”，但这两种机制尚不足以完全解释EGFR-TKI获得性耐药，仍有大约30％左右的患者产生吉非替尼获得性耐药但仍机制不明。因此探索除EGFR突变状态外的其它吉非替尼耐药机制，逆转肺癌细胞对吉非替尼的耐药显得尤为重要。MDM2作为p53的经典抑制因子为人们所熟知，它通过阻断p53介导的基因转录和降解p53来实现其癌蛋白功能。对MDM2的研究已广泛而深入，但多局限于癌细胞凋亡、抗增殖以及细胞周期停滞等方面。然而逐渐有越来越多的证据显示MDM2可以不依赖于p53发挥其癌蛋白的功能。无野生型p53而MDM2表达增高的肿瘤细胞仍然具有高侵袭潜能，且患者往往出现化疗失败的情况。本研究关注于MDM2在肺癌耐吉非替尼的组织样本和细胞株中表达水平，分析MDM2作为预测吉非替尼耐药分子标志物和逆转吉非替尼耐药的可能性。专利技术人进行进一步研究首次发现p-MDM2蛋白的表达水平EGFR-TKI耐药密切相关，可作为吉非替尼耐药的分子标志物，通过设计p-MDM2特异性的干扰序列下调肺癌细胞中p-MDM2蛋白的表达水平可以部分逆转肺癌细胞对吉非替尼的耐药性，为制备逆转非小细胞肺癌对吉非替尼耐药药物提供基础和实验依据。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术的目的是提供MDM2及其干扰序列的新用途。技术方案MDM2在制备作为非小细胞肺癌对吉非替尼耐药标志物中应用。MDM2干扰序列在制备逆转非小细胞肺癌对吉非替尼耐药药物中的应用，所述MDM2干扰序列为：SEQIDNO：1，即gaagttattaaagtctgtt。具体来说：1、应用免疫组化的方法检测51例口服EGFR-TKI患者肺癌组织样本中p-MDM2表达水平，发现：p-MDM2的高表达与EGFR-TKI耐药与较短的生存时间相关。RNA干扰的方法，将MDM2的干扰序列转染至耐吉非替尼的PC-9/G细胞中可以在细胞水平均起到逆转PC-9/G细胞对吉非替尼耐药的效应。有益效果吉非替尼是一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)，其作用机制有：竞争表皮生长因子受体酪氨酸激酶催化区域上的Mg-ATP结合位点，阻断其信号传递；抑制肿瘤血管生成；抑制有丝分裂原活化蛋白激酶的活化，促进细胞凋亡。目前在临床实验中已证实吉非替尼对局部晚期非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌等具有抗肿瘤效应并可改善疾病相关症状；适用于治疗接受过化疗或不适于化疗的局部晚期或转移性非小细胞肺癌(NSCLC)。然而，即使是治疗有效者，多数也会在治疗后6～12个月发生不同程度的耐药现象。最终将导致肿瘤进展，药物的疗效降低，所以研究其耐药机制尤为重要。本专利技术通过合成MDM2的干扰序列并RNA干扰的方法可以显著的下调耐吉非替尼的肺癌细胞中MDM2蛋白的表达水平从而起到逆转耐药的作用。p-MDM2蛋白的表达水平与EGFR-TKI的耐药及不良预后相关提示：p-MDM2蛋白可以作为新的分子标志物在预防非小细胞肺癌对EGFR-TKI的耐药性方面应用。附图说明图1.免疫组化的方法检测口服EGFR-TKI患者肺癌组织样本中p-MDM2表达水平的代表性图片。图2.p-MDM2蛋白表达水平与口服EGFR-TKI疗效的关系的结果.PD:EGFR-TKI耐药的患者；(PR+SD)：EGFR-TKI敏感的患者；*p<0.05,**p<0.01图3.高表达p-MDM2的非小细胞肺癌患者与低表达p-MDM2的非小细胞肺癌患者在口服EGFR-TKI后生存曲线。图4.蛋白免疫印迹实验检测非小细胞肺癌吉非替尼敏感的PC-9细胞株和吉非替尼耐药的PC-9/G细胞株中p-MDM2和MDM2的表达水平。图5.CCK-8方法检测在应用siMDM2干扰后PC-9/G细胞对吉非替尼敏感性的影响。图6.蛋白免疫印迹实验检测非小细胞肺癌吉非替尼耐药的PC-9/G细胞株在应用MDM2干扰后凋亡水平的变化。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术作进一步的阐述，但不限制本专利技术。一般性说明：实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照Sambrook，J等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。本专利技术的材料：本申请中提及的细胞株、脂质体以及培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本专利技术不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。p-MDM2-shRNA慢病毒制备方法：1.p-MDM2干扰序列由本研究团队设计，其序列为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.MDM2在制备作为非小细胞肺癌对吉非替尼耐药标志物中应用。/n

【技术特征摘要】
20191009 CN 20191095242361.MDM2在制备作为非小细胞肺癌对吉非替尼耐药标志物中应用。
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【专利技术属性】
技术研发人员：沈华，吴卫兵，朱陵君，屈晓燕，刘锦源，许晶，
申请(专利权)人：南京医科大学附属逸夫医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32