【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】携带转基因的重组腺病毒相关申请的交叉引用本申请要求2017年5月26日提交的美国临时专利申请第62/511,822号的优先权和权益，该申请通过引用以其整体并入本文。关于序列表的陈述与本申请相关的序列表以文本文件形式代替纸质拷贝提供，其在此通过引用加入到说明书中。包含序列表的文本文件的名称为EPRX_002_01WO_SeqList_ST25.txt。文本文件为约128KB，于2018你那5月29日创建，并且经由EFS-Wbe电子提交。专利
本文所述的专利技术大体上涉及病毒学、病毒疗法和分子生物学领域。
技术介绍
使用病毒疗法以治疗诸如癌症的包括采用带有治疗基因或转基因的选择性复制病毒。在被开发作为病毒治疗剂的多种感染性病毒物种中，腺病毒已成为最重要之一，这不仅是因为它们对正常的非转化细胞具有最小毒性，还因为它们的基因组包含多个内源基因，容易操作，所述操作通常采取缺失内源基因和插入内源基因的方式。这种操作的缺点是大多数内源基因缺失或外源基因添加减慢或减弱了病毒的复制和感染潜力。(Larsonet...
【技术保护点】
1.一种重组腺病毒，包含：插入到插入位点中的核苷酸序列，其中所述插入位点位于第一病毒转录单元的终止密码子和第二病毒转录单元的终止密码子之间，/n其中与所述第一病毒转录单元的起始位点距离所述第二病毒转录单元的终止密码子相比，所述第一病毒转录单元的终止密码子更靠近所述第二病毒转录单元的终止密码子，/n其中与所述第二病毒转录单元的起始位点距离所述第一病毒转录单元的终止密码子相比，所述第二病毒转录单元的终止密码子更靠近所述第一病毒转录单元的终止密码子，和/n其中在插入所述核苷酸序列之前，在所述第一病毒转录单元和所述第二病毒转录单元之间没有病毒转录单元。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170526 US 62/511,8221.一种重组腺病毒，包含：插入到插入位点中的核苷酸序列，其中所述插入位点位于第一病毒转录单元的终止密码子和第二病毒转录单元的终止密码子之间，
其中与所述第一病毒转录单元的起始位点距离所述第二病毒转录单元的终止密码子相比，所述第一病毒转录单元的终止密码子更靠近所述第二病毒转录单元的终止密码子，
其中与所述第二病毒转录单元的起始位点距离所述第一病毒转录单元的终止密码子相比，所述第二病毒转录单元的终止密码子更靠近所述第一病毒转录单元的终止密码子，和
其中在插入所述核苷酸序列之前，在所述第一病毒转录单元和所述第二病毒转录单元之间没有病毒转录单元。
2.如权利要求1所述的重组腺病毒，其中所述第一病毒转录单元是腺病毒IX基因，并且所述第二病毒转录单元是腺病毒IVa2基因。
3.如权利要求1所述的重组腺病毒，其中所述第一病毒转录单元是腺病毒纤维基因，并且所述第二病毒转录单元是腺病毒E4基因的ORF6或ORF6/7。
4.一种重组腺病毒，包含：插入到IX-E2插入位点中的核苷酸序列，其中所述IX-E2插入位点位于腺病毒IX基因的终止密码子和腺病毒IVa2基因的终止密码子之间。
5.如权利要求1、2和4中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列被插入到对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的4029到4093位的核苷酸之间。
6.如权利要求1、2和4中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列被插入到对应于Ad35基因组(SEQIDNO:41)的3899到3970位的核苷酸之间。
7.如权利要求1、2、4和5中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列被插入到对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的4029和4050位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的4050和4070位的核苷酸之间或对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的4070和4093位的核苷酸之间。
8.如权利要求中任一项所述的重组腺病毒1、2、4和6，其中所述核苷酸序列被插入到对应于Ad35基因组(SEQIDNO:41)的3899和3920位的核苷酸之间，对应于Ad35基因组(SEQIDNO:41)的3920和3940位的核苷酸之间或对应于Ad35基因组(SEQIDNO:41)的3940和3970位的核苷酸之间。
9.一种重组腺病毒，包含：插入到L5-E4插入位点中的核苷酸序列，其中所述L5-E4插入位点位于腺病毒纤维基因的终止密码子和腺病毒E4基因的ORF6或ORF6/7的终止密码子之间。
10.如权利要求1、3和9中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列被插入到对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的32785到32916位的核苷酸之间。
11.如权利要求1、3、9和10中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列被插入到对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的32785和32800位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的32800和32820位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的32820和32840位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的32840和32860位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的32860和32880核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的32880和32900位的核苷酸之间或对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的32900和32916位的核苷酸之间。
12.如权利要求1、3和9中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列被插入到对应于Ad35基因组(SEQIDNO:41)的31799和31821位的核苷酸之间。
13.如权利要求中1、3、9和12中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列被插入到对应于Ad35基因组(SEQIDNO:41)的31799和32810位的核苷酸之间或对应于Ad35基因组(SEQIDNO:41)的32810和31821位的核苷酸之间。
14.一种重组腺病毒，包含：插入到IX-E2插入位点中的第一核苷酸序列和插入到L5-E4插入位点中的第二核苷酸序列，其中所述IX-E2插入位点位于腺病毒IX基因的终止密码子和腺病毒IVa2基因的终止密码子之间和其中所述L5-E4插入位点位于腺病毒纤维基因的终止密码子和腺病毒E4基因的ORF6或ORF6/7的终止密码子之间。
15.如权利要求14所述的重组腺病毒，其中所述第一核苷酸序列被插入到对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的4029和4093位的核苷酸之间。
16.如权利要求14或权利要求15所述的重组腺病毒，其中所述第一核苷酸序列被插入到对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的4029和4050位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的4050和4070位的核苷酸之间或对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的4070和4093位的核苷酸之间。
17.如权利要求14所述的重组腺病毒，其中所述第一核苷酸序列被插入到对应于Ad35基因组(SEQIDNO:41)的3899和3970位的核苷酸之间。
18.如权利要求14或权利要求15所述的重组腺病毒，其中所述第一核苷酸序列被插入到对应于Ad35基因组(SEQIDNO:41)的3899和3920位的核苷酸之间，对应于Ad35基因组(SEQIDNO:41)的3920和3940位的核苷酸之间或对应于Ad35基因组(SEQIDNO:41)的3940和3970位的核苷酸之间。
19.如权利要求14-18中任一项所述的重组腺病毒，其中所述第二核苷酸序列被插入到对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的32785到32916位的核苷酸之间。
20.如权利要求14-19中任一项所述的重组腺病毒，其中所述第二核苷酸序列被插入到对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的32785和32800位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的32801和32820位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的32821和32840位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的32841和32860位的核苷酸之间，对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的32861和32880，对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的32881和32900位的核苷酸之间或对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的32901和32916位的核苷酸之间。
21.如权利要求14-18中任一项所述的重组腺病毒，其中所述第二核苷酸序列被插入到对应于Ad5基因组(SEQIDNO:41)的31799和31821位的核苷酸之间。
22.如权利要求14-18和21中任一项所述的重组腺病毒，其中所述第二核苷酸序列被插入到对应于Ad35基因组(SEQIDNO:41)的31799和32810位的核苷酸之间或对应于Ad35基因组(SEQIDNO:41)的32810和31821位的核苷酸之间。
23.如权利要求4-8和14-22中任一项所述的重组腺病毒，其中所述IX-E2插入位点包含约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个核苷酸的缺失。
24.如权利要求9-23中任一项所述的重组腺病毒，其中所述L5-E4插入位点包含约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125或130个核苷酸的缺失。
25.如权利要求1-24中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列包含至少一个转基因。
26.如权利要求所述25的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列进一步包含启动子，其中所述转基因可操作地连接到所述启动子。
27.如权利要求1-26中任一项所述的重组腺病毒，其以5’到3’的方向包含：
(i)第一聚腺苷酸化信号；
(ii)启动子；
(iii)转基因；
(iv)第二聚腺苷酸化信号；和
(v)第三聚腺苷酸化信号；
其中所述转基因可操作地连接到所述启动子，其中所述转基因插入到所述第一聚腺苷酸化信号和所述第三聚腺苷酸化信号之间。
28.如权利要求27所述的重组腺病毒，其中所述第一聚腺苷酸化信号是所述纤维(L5)基因的聚腺苷酸化信号，所述第二聚腺苷酸化信号是所述转基因的聚腺苷酸化信号，并且所述第三聚腺苷酸化信号是所述腺病毒E4基因的ORF6或ORF6/7的聚腺苷酸化信号，或者所述第一聚腺苷酸化信号是所述IX基因的聚腺苷酸化信号，所述第二聚腺苷酸化信号是所述转基因的聚腺苷酸化信号，并且所述第三聚腺苷酸化信号是所述腺病毒IVa2基因的聚腺苷酸化信号。
29.如权利要求1-26中任一项所述的重组腺病毒，其以5’到3’的方向包含：
(i)第一聚腺苷酸化信号；
(ii)第二聚腺苷酸化信号；
(iii)启动子；
(iv)转基因；
(v)第三聚腺苷酸化信号；和
(vi)第四聚腺苷酸化信号；
其中所述转基因可操作地连接到所述启动子，其中所述转基因插入到所述第一聚腺苷酸化信号和所述第四聚腺苷酸化信号之间，和其中所述第二聚腺苷酸化信号位于所述第一聚腺苷酸化信号的相反转录方向。
30.如权利要求29所述的重组腺病毒，其中所述第一聚腺苷酸化信号是所述纤维(L5)基因的聚腺苷酸化信号，所述第三聚腺苷酸化信号是所述转基因的聚腺苷酸化信号，并且所述第四聚腺苷酸化信号是所述腺病毒E4基因的ORF6或ORF6/7的聚腺苷酸化信号，或者所述第一聚腺苷酸化信号是所述IX基因的聚腺苷酸化信号，所述第三聚腺苷酸化信号是所述转基因的聚腺苷酸化信号，并且所述第四聚腺苷酸化信号是所述腺病毒IVa2基因的聚腺苷酸化信号。
31.如权利要求26-30中任一项所述的重组腺病毒，其中所述启动子是泛素启动子、组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子。
32.如权利要求1-31中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒进一步包含插入到E1b-19K插入位点、E3插入位点或E4插入位点中的核苷酸序列。
33.如权利要求1-32中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核苷酸序列包含含有第一转基因的第一核苷酸序列和包含第二转基因的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列通过连接子隔开。
34.如权利要求33所述的重组腺病毒，其中所述连接子编码可通过一种蛋白酶或多种蛋白酶切割的肽。
35.如权利要求33或权利要求34所述的重组腺病毒，其中所述连接子编码内部核糖体进入位点(IRES)或自切割2A肽。
36.如权利要求32所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点位于Elb-19K的起始位点和Elb-19K的终止密码子之间。
37.如权利要求32或权利要求36所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点在邻近E1b-19K的起始位点处包含约100至约305，约100至约300，约100至约250，约100至约200，约100至约150，约150至约305，约150至约300，约150至约250或约150至约200个核苷酸的缺失。
38.如权利要求32、36和37中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点在邻近E1b-19K的起始位点处包含约200个核苷酸的缺失。
39.如权利要求32、36和37中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的核苷酸1714-1917的缺失。
40.如权利要求32、36和37中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含对应于Ad35基因组(SEQIDNO:41)的核苷酸1611-2153的缺失。
41.如权利要求32所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点位于腺病毒pVIII基因的终止密码子和腺病毒纤维基因的起始位点之间。
42.如权利要求32或权利要求41所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点位于E3-10.5K的终止密码子和E3-14.7K的终止密码子之间。
43.如权利要求32、41和42中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含约500至约3185，约500至约3000，约500至约2500，约500至约2000，约500至约1500，约500至约1000，约1000至约3185，约1000至约3000，约1000至约2500，约1000至约2000，约1000至约1500，约1500至约3185，约1500至约3000，约1500至约2000，约2000至约3185，约2000至约3000，约2000至约2500，约2500至约3185，约2500至约3000或约3000至约3185个核苷酸的缺失。
44.如权利要求32和41-43中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点在邻近E3-10.5K的终止密码子处包含约500至约1551，约500至约1500，约500至约1000，约1000至约1551，约1000至约1500或约1500至约1551个核苷酸的缺失。
45.如权利要求32和41-44中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点在邻近E3-10.5K的终止密码子处包含约1,050个核苷酸的缺失。
46.如权利要求32和41-44中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点在E3-10.5K的终止密码子之后包含1,063个核苷酸的缺失。
47.如权利要求32和41-43中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含对应于Ad5dl309E3缺失的缺失。
48.如权利要求32和41-47中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的核苷酸29773-30836的缺失。
49.如权利要求32和41-46中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含对应于Ad35基因组(SEQIDNO:41)的核苷酸29119-30622的缺失。
50.如权利要求1-49中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含具有功能性Pea3结合位点的一个或多个缺失的E1a启动子。
51.如权利要求50所述的重组腺病毒，其中所述缺失包含对应于Ela起始位点上游约-300至约-250的核苷酸的缺失。
52.如权利要求50所述的重组腺病毒，其中所述缺失包含对应于Ela起始位点上游-305至-255的核苷酸的缺失。
53.如权利要求50所述的重组腺病毒，其中所述缺失包含对应于Ad5基因组(SEQIDNO:1)的195-244的核苷酸的缺失。
54.如权利要求50所述的重组腺病毒，其中所述E1a启动子包含序列GGTGTTTTGG(SEQIDNO:4)。
55.如权利要求1-54中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒在E1A区中包含一个或多个Pea3转录结合位点缺失，而没有一个或多个E2F转录结合位点缺失。
56.如权利要求1-54中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒在E1A区中包含一个或多个E2F转录结合位点缺失，而没有一个或多个Pea3转录结合位点缺失。
57.如权利要求1-48中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含可操作地连接至基因的修饰的基于TATA框的启动子，其中所述修饰的基于TATA框的启动子缺乏功能性TATA框并允许所述基因在过度增殖细胞中的选择性表达，和/或可操作地连接至基因的修饰的基于CAAT框的启动子，其中所述修饰的基于CAAT框的启动子缺乏功能性CAAT框并允许所述基因在过度增殖细胞中的选择性表达。
58.如权利要求57所述的重组腺病毒，其中所述修饰的基于TATA框的启动子是早期基因启动子。
59.如权利要求58所述的重组腺病毒，其中所述修饰的基于TATA框的启动子是E1a启动子、E1b启动子或E4启动子。
60.如权利要求59所述的重组腺病毒，其中所述修饰的基于TATA框的启动子是E1a启动子。
61.如权利要求57-60中任一项所述的重组腺病毒，其中所述修饰的基于TATA框的启动子中所包含的修饰包括整个TATA框的缺失。
62.如权利要求57-60中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于所述E1a启动子的-27至-24的核苷酸的缺失。
63.如权利要求57-62中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于所述E1a启动子的-31至-24的核苷酸的缺失。
64.如权利要求57-63中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于所述E1a启动子的-44至+54的核苷酸的缺失。
65.如权利要求57-64中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于所述E1a启动子的-146至+54的核苷酸的缺失。
66.如权利要求57-60中...
【专利技术属性】
技术研发人员：C拉森，B奥隆斯基，TR雷德，
申请(专利权)人：埃皮森特RX股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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