抗III型纤连蛋白结构域的抗原结合区及其使用方法技术

III型纤连蛋白(FN3)结构域抗体、能够编码所述FN3结构域抗体或抗原结合片段的多核苷酸、表达FN3结构域抗体或抗原结合片段的细胞、以及相关载体和可检测标记的FN3结构域抗体或抗原结合片段可用于工程化靶向FN3结构域的嵌合抗原受体(CAR)。制备所述FN3结构域抗体、CAR和工程化免疫细胞的方法，以及使用所述工程化免疫细胞的方法适用于治疗包括癌症在内的疾病。

Antigenic binding region of anti type III fibronectin domain and its application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗III型纤连蛋白结构域的抗原结合区及其使用方法序列表本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2018年6月29日，命名为JBI5032WOPCTSL.txt，并且大小为88,120字节。
本专利技术涉及特异性地结合III型纤连蛋白结构域(FN3结构域)的抗体以及制备和使用所述抗体的方法。
技术介绍
基于纤粘蛋白的支架是能够进化以结合任何感兴趣的化合物的蛋白质家族。这些蛋白质通常使用来源于III型纤连蛋白(FN3)或FN3样结构域的支架，其以天然或工程化抗体(即多克隆抗体、单克隆抗体或单链抗体)的特性的方式发挥作用，并且另外具有结构优势。具体地，这些抗体模拟物的结构已被设计用于最佳的折叠、稳定性和溶解度，即使在通常导致抗体的结构和功能丧失的条件下也是如此。基于纤连蛋白的支架蛋白的示例是CentyrinTM(Jacobs等人，ProteinEngineering，Design，andSelection，25：107-117，2012；US2010/0216708)。III型纤连蛋白(Fn3)结构域按从N末端到C末端的顺序包含β或β样链，A；环，AB；β或β样链，B；环，BC；β或β样链C；环CD；β或β样链D；环DE；β或β样链，E；环，EF；β或β样链F；环FG；以及β或β样链G。环AB、BC、CD、DE、EF和FG中的任一个或全部可参与靶结合。BC、DE和FG环在结构上和功能上与来自免疫球蛋白的互补决定区(CDR)类似。考虑到小尺寸、不含二硫键、高稳定性和在原核宿主中表达的能力，FN3结构域已获得生物医药目的。FN3结构域可容易地缀合至药物/毒素，有效地渗透到组织中，并且易于格式化为多特异性结合剂和融合蛋白，包括嵌合抗原受体(CAR)。尽管存在多功能性，但目前不存在特异性地结合FN3结构域以用于检测、测定或生物制药目的的抗体。
技术实现思路
本专利技术包括结合III型纤连蛋白(FN3)结构域的非随机化区的抗体和抗原结合片段。本文还描述了能够编码所提供的FN3结构域抗体和抗原结合片段的相关多核苷酸、表达所提供的抗体和抗原结合片段的细胞、以及相关载体和可检测标记的FN3结构域抗体和抗原结合片段。如通过在实施例3中所示的条件下通过ELISA测量的，抗体或其抗原结合片段不选择性地结合FN3结构域的随机化区。此外，还描述了使用所提供的FN3结构域抗体和抗原结合片段的方法。所述FN3结构域抗体和抗原结合片段可用于检测包含FN3结构域的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞表面表达。在另一个实施方案中，所述FN3结构域抗体和抗原结合片段可用于激活表达包含FN3结构域的CAR的T细胞。在另一个实施方案中，所述FN3结构域抗体或抗原结合片段可用于生成包含所述抗原结合片段的CAR。在一些实施方案中，本专利技术包含分离的抗体和抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段特异性地结合FN3结构域的非随机化区。这些FN3结构域抗体或其抗原结合片段可检测包含FN3结构域的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞表面表达。在一些实施方案中，FN3结构域抗体或抗原结合片段激活表达包含FN3结构域的CAR的T细胞。在一些实施方案中，FN3结构域抗体和抗原结合片段结合在环区中被修饰的FN3结构域。表1提供本文所述的FN3结构域特异性抗体的CDR序列。表1：FN3结构域特异性抗体的CDR序列(SEQIDNO：)在一些实施方案中，FN3抗体或其抗原结合片段包含含有表1所述氨基酸序列中的任一种的CDR1、CDR2和CDR3的重链以及含有表1所述氨基酸序列中的任一种的CDR1、CDR2和CDR3的轻链。本专利技术的FN3结构域抗体可包含SEQIDNO：14的重链可变区序列，并且可包含SEQIDNO：15的轻链可变区序列。在其它实施方案中，本专利技术的FN3结构域抗体可包含SEQIDNO：74的重链可变区序列，并且可包含SEQIDNO：75的轻链可变区序列。在其它实施方案中，本专利技术的FN3结构域抗体可包含SEQIDNO：78的重链可变区序列，并且可包含SEQIDNO：79的轻链可变区序列。本文所述的FN3结构域抗体包括具有与IgG同种型中的任一种组合的CDR和可变结构域的所述特征的抗体，包括其中Fc序列已经被修饰以实现不同效应功能的修饰型式。除所述FN3结构域抗体和抗原结合片段之外，还提供了能够编码FN3结构域抗体和抗原结合片段的多核苷酸序列。还提供了包含所述多核苷酸的载体，以及表达本文提供的FN3结构域抗体或抗原结合片段的细胞。还描述了能够表达所公开的载体的细胞。这些细胞可以是哺乳动物细胞(诸如293F细胞、CHO细胞)、昆虫细胞(诸如Sf9细胞)、酵母细胞、植物细胞或细菌细胞(诸如大肠杆菌(E.coli))。还提供了用于制备FN3结构域抗体或抗原结合片段的方法。本专利技术还包括本专利技术的CAR，其包含分离的多肽，所述分离的多肽包含：(a)胞外结构域，所述胞外结构域具有scFv，所述scFv特异性地结合FN3结构域的非随机化区；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内信号结构域。CAR还可包含使胞外结构域和跨膜结构域连接的铰链区。在一些实施方案中，CAR分离的多肽包含：(a)胞外结构域，所述胞外结构域包含本专利技术的FN3结构域，诸如具有与SEQIDNO：68-73之一，优选地SEQIDNO：68-73之一有至少90％同一性的氨基酸序列的FN3结构域；(b)铰链区，所述铰链区具有与SEQIDNO：24有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有SEQIDNO：24的氨基酸序列；(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域具有与SEQIDNO：25有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有SEQIDNO：25的氨基酸序列；以及(d)胞内信号结构域，所述胞内信号结构域包含具有与SEQIDNO：26有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有SEQIDNO：26的共同刺激结构域以及具有与SEQIDNO：27有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有SEQIDNO：27的初级信号结构域。本专利技术还包括编码本专利技术的CAR的分离的多核苷酸，其包含：(a)胞外结构域，所述胞外结构域具有scFv，所述scFv特异性地结合FN3结构域的非随机化区；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内信号结构域。CAR还可包含使胞外结构域和跨膜结构域连接的铰链区。在一些实施方案中，分离的多核苷酸编码CAR，所述CAR包含：(a)胞外结构域，所述胞外结构域包含本专利技术的FN3结构域，诸如具有与SEQIDNO：68-73之一，优选地SEQIDNO：68-73之一有至少90％同一性的氨基酸序列的FN3结构域；(b)铰链区，所述铰链区具有与SEQIDNO：24有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有SEQIDNO：24的氨基酸序列；(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合III型纤连蛋白(FN3)结构域的非随机化区。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170717 US 62/533341;20180202 US 62/6255761.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合III型纤连蛋白(FN3)结构域的非随机化区。


2.根据权利要求1所述的分离的抗体或抗原结合片段，包含：
a.具有SEQIDNO：1的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQIDNO：4的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQIDNO：7的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQIDNO：9的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQIDNO：11的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQIDNO：13的氨基酸序列的轻链CDR3；
b.具有SEQIDNO：2的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQIDNO：5的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQIDNO：8的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQIDNO：10的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQIDNO：12的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQIDNO：13的氨基酸序列的轻链CDR3；
c.具有SEQIDNO：3的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQIDNO：6的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQIDNO：8的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQIDNO：10的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQIDNO：12的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQIDNO：13的氨基酸序列的轻链CDR3；
d.具有SEQIDNO：35的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQIDNO：41的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQIDNO：44的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQIDNO：46的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQIDNO：48的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQIDNO：50的氨基酸序列的轻链CDR3；
e.具有SEQIDNO：36的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQIDNO：42的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQIDNO：45的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQIDNO：47的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQIDNO：49的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQIDNO：50的氨基酸序列的轻链CDR3；
f.具有SEQIDNO：37的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQIDNO：43的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQIDNO：45的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQIDNO：47的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQIDNO：49的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQIDNO：50的氨基酸序列的轻链CDR3；
g.具有SEQIDNO：38的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQIDNO：51的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQIDNO：54的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQIDNO：56的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQIDNO：58的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQIDNO：60的氨基酸序列的轻链CDR3；
h.具有SEQIDNO：39的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQIDNO：52的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQIDNO：55的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQIDNO：57的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQIDNO：59的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQIDNO：61的氨基酸序列的轻链CDR3；或者
i.具有SEQIDNO：40的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQIDNO：53的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQIDNO：55的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQIDNO：57的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQIDNO：59的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQIDNO：61的氨基酸序列的轻链CDR3。


3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中
d.所述抗体的可变重链包括SEQIDNO：14的氨基酸序列，并且所述抗体的可变轻链包括SEQIDNO：15的氨基酸序列；
e.所述抗体的可变重链包括SEQIDNO：74的氨基酸序列，并且所述抗体的可变轻链包括SEQIDNO：75的氨基酸序列；或者
f.所述抗体的可变重链包括SEQIDNO：78的氨基酸序列，并且所述抗体的可变轻链包括SEQIDNO：79的氨基酸序列。


4.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中
e.所述抗体的重链包括SEQIDNO：18的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链包括SEQIDNO：19的氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：C黄，J李，J穆尼，M纳索，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国;US